光學(xué)顯微鏡是生物醫(yī)學(xué)研究必不可少的工具，其中雙光子顯微成像技術(shù)具有大深度三維顯微成像功能，被認(rèn)為是深層生物組織研究的首選工具。

但是，在雙光子成像系統(tǒng)使用過(guò)程中，光學(xué)系統(tǒng)的裝配偏差、光學(xué)元件不理想以及生物樣品的不均勻性都會(huì)在成像過(guò)程中引入像差，從而降低成像質(zhì)量。通過(guò)在雙光子顯微成像系統(tǒng)中引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)像差的有效校正，從而提高成像的分辨率、深度和視場(chǎng)。

深圳的章辰、高玉峰團(tuán)隊(duì)在《中國(guó)激光》發(fā)表文章，介紹了雙光子顯微成像中的像差來(lái)源和特點(diǎn)，概述了自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)中不同的探測(cè)和校正方法，綜述了近年來(lái)自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)在雙光子顯微成像中不同的應(yīng)用成果，最后對(duì)自適應(yīng)光學(xué)在雙光子顯微成像中的發(fā)展進(jìn)行了展望。

雙光子顯微成像技術(shù)及其像差分析
雙光子顯微成像技術(shù)是基于雙光子效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。在一般情況下，熒光分子會(huì)吸收一個(gè)高能量的光子，從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，經(jīng)過(guò)一段弛豫時(shí)間后回到基態(tài)，同時(shí)輻射出一個(gè)能量比激發(fā)光光子能量小但是波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光子，這就是單光子效應(yīng)。

然而，在高光子密度的條件下，熒光分子可同時(shí)吸收兩個(gè)能量較小、波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，隨后在激發(fā)態(tài)弛豫一段時(shí)間后再回到基態(tài)，這時(shí)輻射出能量比激發(fā)光光子能量高但是小于兩個(gè)光子能量總和的光子，這就是雙光子效應(yīng)。

雙光子顯微成像系統(tǒng)中的像差主要有兩個(gè)來(lái)源：一是由光學(xué)系統(tǒng)裝調(diào)和光學(xué)元件不理想引入的像差，稱之為系統(tǒng)像差；二是由生物樣品的折射率不均勻性引入的像差，稱之為樣品像差。

其中，系統(tǒng)像差通常為固定的低階像差，不隨時(shí)間變化，因此可以通過(guò)對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)來(lái)減小像差，同時(shí)也可以預(yù)先測(cè)量、標(biāo)定和補(bǔ)償像差。與系統(tǒng)像差相比，樣品像差除了大部分的低階像差以外，還包括更復(fù)雜的高階像差，這些像差通常會(huì)隨著成像深度的增加而增大。由于不同樣品或同一樣品不同區(qū)域的散射體大小和折射率不盡相同，不同樣品或同一樣品不同區(qū)域產(chǎn)生的像差也不一樣，因此樣品像差是無(wú)規(guī)律的、不可預(yù)測(cè)的，這也是雙光子顯微成像系統(tǒng)中最主要也是最難消除的像差。

雙光子顯微成像系統(tǒng)包含了激發(fā)光和發(fā)射光兩條光路，激發(fā)光在生物樣品上聚焦以激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。而生物樣品的折射率不均勻性會(huì)降低激發(fā)光的聚焦能力，進(jìn)而影響熒光發(fā)射。因此在進(jìn)行像差補(bǔ)償時(shí)，對(duì)激發(fā)光光路進(jìn)行像差校正是必須的。對(duì)于發(fā)射光而言，通常采用光電倍增管（PMT）進(jìn)行點(diǎn)探測(cè)成像，成像過(guò)程實(shí)際上是對(duì)熒光能量進(jìn)行收集，發(fā)射光光路中的像差對(duì)成像質(zhì)量的影響可忽略，因此無(wú)須對(duì)發(fā)射光光路進(jìn)行像差校正。

自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)
在AO技術(shù)中，通常把波前探測(cè)方法分為兩類：一類是使用波前傳感器（WS）基于幾何光學(xué)原理對(duì)波前進(jìn)行探測(cè)，稱之為直接波前探測(cè)；另一類是不使用波前傳感器，而是通過(guò)優(yōu)化算法對(duì)一系列圖像進(jìn)行計(jì)算，推導(dǎo)得出波前，稱之為間接波前探測(cè)。

間接波前探測(cè)
間接波前探測(cè)的概念最早來(lái)自1974年出現(xiàn)的像清晰化技術(shù)，但是隨著20世紀(jì)90年代后期硬件技術(shù)的革新和優(yōu)化控制算法的更新，間接波前探測(cè)的應(yīng)用才開始蓬勃發(fā)展起來(lái)。間接波前探測(cè)無(wú)需專門的波前傳感器，直接利用成像探測(cè)器獲得的光強(qiáng)信息建立像質(zhì)評(píng)價(jià)函數(shù)，然后基于特定的優(yōu)化算法在波前校正器上附加某些特定的相位，以尋找評(píng)價(jià)函數(shù)的極值，達(dá)到獲取最優(yōu)信號(hào)強(qiáng)度的目的，當(dāng)評(píng)價(jià)函數(shù)達(dá)到極值時(shí)認(rèn)為畸變波前已得到了校正。間接波前探測(cè)又可細(xì)分為搜索算法和模式法兩大類。

直接波前探測(cè)
直接波前探測(cè)是通過(guò)波前探測(cè)器和波前重建算法來(lái)獲得畸變波前的相位分布，然后將相位信息反饋給波前校正器，波前校正器產(chǎn)生一個(gè)與畸變波前互補(bǔ)的補(bǔ)償波前，從而達(dá)到波前校正的目的。常用的波前探測(cè)器是夏克-哈特曼波前傳感器（SHWS），其工作原理是首先利用微透鏡陣列把畸變波前分割成多個(gè)小塊并聚焦到照相機(jī)的靶面上，通過(guò)照相機(jī)采集各個(gè)焦點(diǎn)的空間位置信息，然后計(jì)算各個(gè)焦點(diǎn)與微透鏡陣列理想中心點(diǎn)的偏移量，得到畸變波前的斜率分布，最后根據(jù)Zernike梯度多項(xiàng)式計(jì)算得到畸變波前的相位分布。

干涉測(cè)量技術(shù)
干涉測(cè)量技術(shù)是另一種非接觸、高精度的直接波前探測(cè)技術(shù)，目前在天文探測(cè)、光學(xué)元件精密制造、眼科治療等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。在干涉測(cè)量技術(shù)中，通常使用相移法使參考光與被測(cè)光之間產(chǎn)生穩(wěn)定變化的相位差，通過(guò)多幅相位差圖像計(jì)算出兩束光波前的相位差信息，再根據(jù)干涉測(cè)量的具體工作原理，得到被測(cè)光路中的畸變波前相位分布。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干涉測(cè)量技術(shù)已從一種靜態(tài)測(cè)量技術(shù)發(fā)展為動(dòng)態(tài)測(cè)量技術(shù)，其測(cè)量速度已使其可以用于活體成像。

波前校正方法
波前校正器是AO系統(tǒng)中進(jìn)行像差校正的執(zhí)行器件，通過(guò)改變?nèi)肷涔馐�不同位置的光程差�?lái)進(jìn)行畸變波前的相位補(bǔ)償。波前的畸變?cè)诒举|(zhì)上是光程的差異，光程可表示為光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過(guò)的路程與傳輸介質(zhì)折射率的乘積，因此可以通過(guò)改變光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過(guò)的路程或改變傳輸介質(zhì)的折射率來(lái)對(duì)畸變波前進(jìn)行補(bǔ)償。

因此，波前校正器可分為兩類：一類是通過(guò)改變傳輸介質(zhì)折射率來(lái)實(shí)現(xiàn)相位補(bǔ)償?shù)牟ㄇ靶Ｕ�器，如液晶空間光調(diào)制器（SLM）；另一類是通過(guò)改變光在傳輸介質(zhì)中經(jīng)過(guò)的路程來(lái)進(jìn)行相位補(bǔ)償?shù)牟ㄇ靶Ｕ�器，如變形鏡（DM）。

SLM進(jìn)行相位調(diào)制是通過(guò)偏轉(zhuǎn)液晶面板上的雙折射液晶分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的：在液晶面板的兩端施加不同的電壓，雙折射液晶分子隨著電壓的變化而產(chǎn)生不同的偏轉(zhuǎn)角度，使液晶面板的折射率發(fā)生變化，從而改變穿過(guò)液晶的光程，實(shí)現(xiàn)相位調(diào)制。此外，可以通過(guò)調(diào)制電壓獨(dú)立地改變SLM上每一個(gè)像素對(duì)應(yīng)的液晶分子折射率，實(shí)現(xiàn)高空間分辨率的相位調(diào)制。但是，SLM具有偏振依賴性，入射光必須為線偏振光才能實(shí)現(xiàn)相位調(diào)制，大大降低了器件的光能利用率。因此，在雙光子顯微成像系統(tǒng)中，必須提高激發(fā)光的功率，才能保證SLM校正后的激發(fā)光能量足以激發(fā)熒光。

DM是通過(guò)改變反射鏡的表面形狀來(lái)改變DM反射的光程，從而實(shí)現(xiàn)相位補(bǔ)償。根據(jù)驅(qū)動(dòng)器的不同，常用的DM有微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）變形鏡和壓電陶瓷變形鏡。MEMS變形鏡采用的是微機(jī)電技術(shù)，主要由鏡面層、電極層和基底層組成，反射鏡為反射率較高的鍍鋁或鍍銀薄膜，在給電極層上分布的各個(gè)電極施加不同的電壓后，鏡面層與電極層之間會(huì)產(chǎn)生電勢(shì)差，從而產(chǎn)生靜電力吸附薄膜，使反射鏡產(chǎn)生形變。壓電陶瓷變形鏡是通過(guò)改變壓電驅(qū)動(dòng)器的控制電壓來(lái)實(shí)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)器的伸縮，進(jìn)而帶動(dòng)驅(qū)動(dòng)器支撐的反射鏡產(chǎn)生形變。相比于SLM，DM的校正速度更快，也無(wú)偏振依賴性，但是DM的空間分辨率受驅(qū)動(dòng)器個(gè)數(shù)的限制，且價(jià)格相對(duì)昂貴。

前沿應(yīng)用
具有高成像分辨率及大成像深度和視場(chǎng)的顯微成像技術(shù)一直是雙光子顯微成像乃至整個(gè)顯微成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中AO技術(shù)在探測(cè)和校正像差中發(fā)揮了重要作用。自2000年AO技術(shù)首次被應(yīng)用于雙光子顯微成像以來(lái)，不同探測(cè)方法和校正方法的成功應(yīng)用使得具有大視場(chǎng)、高成像分辨率的深層生物組織活體成像成為可能。

間接波前探測(cè)方法在雙光子顯微成像中的應(yīng)用
1.基于子孔徑分割的算法
Ji等提出基于子孔徑分割的間接波前探測(cè)算法，使用SLM調(diào)制波前相位，對(duì)小鼠大腦皮層切片產(chǎn)生的像差進(jìn)行預(yù)校正，能達(dá)到近衍射極限的成像分辨率；Tang等提出二分迭代法的間接波前探測(cè)算法，提高了波前探測(cè)速度和成像分辨率，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元的成像；Wang等引入數(shù)字微鏡器件（DMD），縮短了校正時(shí)長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元的成像；Rodríguez等設(shè)計(jì)了更緊湊的子孔徑探測(cè)模塊，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠大腦皮層和脊髓中神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)成像以及脊髓神經(jīng)元中鈣離子的功能成像，在三光子顯微成像系統(tǒng)中進(jìn)一步提升了成像深度；本課題組提出環(huán)形子孔徑分割算法，用于校正旋轉(zhuǎn)對(duì)稱像差，能達(dá)到近衍射極限的成像分辨率。

2.基于模式法的算法
Park等提出基于模式法的間接波前探測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)像差校正；Streich等將基于模式法的無(wú)波前探測(cè)技術(shù)引入到三光子顯微成像系統(tǒng)中，增大了成像深度；研究團(tuán)隊(duì)對(duì)視場(chǎng)進(jìn)行子孔徑分割，提高了視場(chǎng)邊緣的成像分辨率，實(shí)現(xiàn)了大視場(chǎng)成像。

間接波前探測(cè)方法結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)成像對(duì)象無(wú)限制，易于實(shí)現(xiàn)，但波前校正過(guò)程計(jì)算量大、耗時(shí)長(zhǎng)，很難滿足快速成像需求，測(cè)量精度低于直接波前探測(cè)。

直接波前探測(cè)方法在雙光子顯微成像中的應(yīng)用
1.使用外源熒光物質(zhì)作為引導(dǎo)星
Cha等、Tao等在樣品里注射外源熒光物質(zhì)作為引導(dǎo)星，對(duì)離體小鼠大腦組織進(jìn)行成像，提高了成像分辨率，但該方法會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生干擾且引導(dǎo)星空間位置難精確控制，未被廣泛使用。

2.使用雙光子激發(fā)的熒光作為引導(dǎo)星
Wang等認(rèn)為雙光子激發(fā)的熒光可作為引導(dǎo)星，提出去掃描技術(shù)提高直接波前探測(cè)的質(zhì)量和效率，使用SLM對(duì)激發(fā)光進(jìn)行校正，對(duì)開顱活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行結(jié)構(gòu)成像，將引導(dǎo)星改為近紅外熒光蛋白，對(duì)活體小鼠大腦皮層神經(jīng)元中的鈣離子傳導(dǎo)進(jìn)行功能成像，成像深度達(dá)700μm；Liu等將近紅外熒光染料作為引導(dǎo)星，將波前校正器換成DM，對(duì)小鼠大腦皮層中的微血管和神經(jīng)元進(jìn)行結(jié)構(gòu)成像，成像深度可達(dá)1100μm，對(duì)神經(jīng)元釋放谷氨酸和鈣離子的過(guò)程進(jìn)行功能成像，提升了成像質(zhì)量；Qin等將DM置于去掃描后的探測(cè)光路中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)激發(fā)光的迭代校正，優(yōu)化了波前重建算法和雙光子顯微成像系統(tǒng)中激發(fā)光的數(shù)值孔徑，降低了激發(fā)光的散射效應(yīng)，增加了探測(cè)深度，通過(guò)與光透明技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了小鼠顱骨完整狀態(tài)下大腦皮層神經(jīng)元的成像，成像深度為700μm。

直接波前探測(cè)方法能夠得到畸變波前的客觀描述，測(cè)量速度更快、準(zhǔn)確度更高，但系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，會(huì)降低成像信噪比，波前探測(cè)器的靈敏度和探測(cè)精度也會(huì)受信噪比影響。

F-SHARP技術(shù)在雙光子顯微成像中的應(yīng)用
1.技術(shù)原理
Papadopoulos等提出聚焦掃描全息像差探測(cè)（F-SHARP）方法，通過(guò)雙光束干涉直接測(cè)量畸變波前的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），并使用測(cè)量得到的PSF相位的共軛來(lái)校正波前。

2.應(yīng)用進(jìn)展
Qin等在F-SHARP系統(tǒng)中將遠(yuǎn)程聚焦方法與共軛AO相結(jié)合，使用鎖相放大器簡(jiǎn)化PSF的測(cè)量步驟，提高了畸變波前的測(cè)量速度和準(zhǔn)確度，將改進(jìn)后的F-SHARP技術(shù)應(yīng)用于三光子顯微成像系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦皮層神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)成像和海馬體的高分辨率成像。

3.技術(shù)特點(diǎn)
無(wú)需專門的波前傳感器，將發(fā)射光全部用于成像，保證了成像信噪比；使用雙光束干涉技術(shù)，部分激發(fā)光功率損失，但探測(cè)時(shí)間大幅縮短，與快速相移技術(shù)結(jié)合，探測(cè)速度進(jìn)一步提升。

總結(jié)與展望
具有更大成像視場(chǎng)、更深成像深度和更高成像分辨率的雙光子顯微成像系統(tǒng)可為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究提供更豐富、準(zhǔn)確的影像信息，AO技術(shù)將在顯微成像領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為成像質(zhì)量的突破提供技術(shù)支持。未來(lái)，加快畸變波前的探測(cè)和校正速度、提升校正的動(dòng)態(tài)范圍是實(shí)現(xiàn)活體快速成像的必經(jīng)之路，將各種探測(cè)、校正和控制技術(shù)有效結(jié)合，以及與其他技術(shù)融合，將是研究的重點(diǎn)。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于:章辰, 高玉峰, 葉世蔚, 李慧, 鄭煒. 自適應(yīng)光學(xué)在雙光子顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)激光, 2023, 50(3): 0307103. Chen Zhang, Yufeng Gao, Shiwei Ye, Hui Li, Wei Zheng. Application of Adaptive Optics in Two‑photon Microscopic Imaging[J]. Chinese Journal of Lasers, 2023, 50(3): 0307103.