在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，雙光子成像技術(shù)因其高成像分辨率、大深度和強三維層析能力等優(yōu)點，成為獲取關(guān)鍵高分辨三維信息的重要手段。然而，傳統(tǒng)雙光子顯微鏡成像視場有限，通常在1mm以內(nèi)，極大地限制了其在更廣泛生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。

為拓展雙光子顯微鏡的成像視場，研究人員嘗試了多種方法。例如，通過設(shè)計特殊的掃描中繼系統(tǒng)來減小大角度掃描引起的離軸像差，或自制高通量物鏡來實現(xiàn)更大的成像視場。但這些方法往往實現(xiàn)難度大、成本高，難以在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域廣泛推廣。

近年來，一種通過自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)增加成像物鏡可用視場的方法被提出。然而，該方法需要在光學(xué)系統(tǒng)中增加相位補償器件，這增加了成像系統(tǒng)的光路復(fù)雜性與硬件成本。

在此背景下，來自曲阜師范大學(xué)、香港理工大學(xué)的李遲件團(tuán)隊提出了一種利用深度學(xué)習(xí)替代自適應(yīng)光學(xué)相位補償從而擴(kuò)展雙光子成像視場的新方法。

深度學(xué)習(xí)帶來的新突破
商用物鏡通常有一個廠商標(biāo)定的成像視場，在該范圍內(nèi)，物鏡像差可忽略，成像質(zhì)量好；超過該視場后，物鏡像差急劇增大，成像質(zhì)量嚴(yán)重劣化。

研究團(tuán)隊之前通過自適應(yīng)光學(xué)方法使擴(kuò)展視場的成像質(zhì)量與信噪比接近于標(biāo)定視場區(qū)域，成功拓展了大視場物鏡的可用視場。而本文所提方法通過采集擴(kuò)展視場自適應(yīng)光學(xué)校正前后的數(shù)據(jù)并使用改進(jìn)網(wǎng)絡(luò)框架進(jìn)行訓(xùn)練，無需使用自適應(yīng)光學(xué)相位補償裝置進(jìn)行像差校正便可得到近似無像差的圖像。

該方法具有以下優(yōu)勢：

• 無需復(fù)雜光學(xué)元件：無須使用復(fù)雜的自適應(yīng)光學(xué)元件進(jìn)行像差校正。

• 降低成本與提高便捷性：利用深度學(xué)習(xí)替代硬件自適應(yīng)光學(xué)補償，不僅降低了系統(tǒng)成本，還實現(xiàn)了無須硬件自適應(yīng)光學(xué)補償?shù)拇笠晥龀上�，提高了系統(tǒng)的便捷性。

實驗過程
在實驗中，研究團(tuán)隊使用了大視場雙光子顯微系統(tǒng)，包括鈦藍(lán)寶石激光器、擴(kuò)束器、中繼鏡、檢流計、掃描振鏡、物鏡、二向分光鏡、收集透鏡和光電倍增管等。采用間接波前檢測中的模式法實現(xiàn)像差測量和校正，將整個視場區(qū)域分為3×3個子區(qū)域進(jìn)行分區(qū)校正，使用Zernike多項式的第5-15項進(jìn)行像差計算，重復(fù)測量三次后取平均以保證測量準(zhǔn)確度。

為提高神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可靠性，研究團(tuán)隊對數(shù)據(jù)準(zhǔn)備進(jìn)行了兩方面改進(jìn)：

• 提高信噪比：對每組校正前后的圖像各采集3張，并通過平均圖像的灰度值來提高圖像的信噪比。

• 匹配三維位置：將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)校正前的圖像作為參照，對校正后的圖像進(jìn)行X和Y方向的配準(zhǔn)，將配準(zhǔn)后的有效數(shù)據(jù)尺寸裁剪為1000pixel×1000pixel。

研究團(tuán)隊采用的基于U-Net改進(jìn)的nBRAnet網(wǎng)絡(luò)，具有U型對稱結(jié)構(gòu)，保留了多個跳躍連接結(jié)構(gòu)。同時，引入殘差結(jié)構(gòu)以緩解反向傳播造成的梯度爆炸和梯度消失，提高網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)度和精度；引入輕量級的空間注意力機制以增強網(wǎng)絡(luò)性能；移除了所有卷積塊中的BN層以增強網(wǎng)絡(luò)輸出的圖像質(zhì)量。

在網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練設(shè)置方面，研究團(tuán)隊在Windows環(huán)境下進(jìn)行，采用 PyTorch（Python3.7）編寫代碼，使用MATLAB代碼處理圖片，在桌面工作站上進(jìn)行。數(shù)據(jù)集由熒光小球和離體生物樣品經(jīng)自適應(yīng)光學(xué)校正前后的顯微圖像構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)模型輸入圖像和輸出圖像的尺寸均為1000pixel×1000pixel，分別取數(shù)據(jù)集的95％和5％用作訓(xùn)練集和測試集，利用網(wǎng)絡(luò)輸出與標(biāo)簽之間的均方誤差作為損失函數(shù)來訓(xùn)練模型，同時利用反向傳播算法Adam來優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)，初始學(xué)習(xí)速率為1×10-4。

實驗結(jié)果
熒光小球?qū)嶒?/em>：無論是在像差較小的標(biāo)定視場區(qū)域，還是在具有較大離軸像差的擴(kuò)展視場區(qū)域，研究團(tuán)隊所提網(wǎng)絡(luò)均能較好地校正畸變的圖像，證明了深度學(xué)習(xí)技術(shù)可以替代硬件自適應(yīng)光學(xué)像差校正技術(shù)擴(kuò)展成像視場并實現(xiàn)畸變圖像的校正。