引言

大型多細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)時(shí)成像是現(xiàn)代生物學(xué)研究中的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)顯微鏡技術(shù)在提供高分辨率三維圖像方面常有不足，尤其是對(duì)于需要最小光毒性的深層樣本。開發(fā)開放式多樣本雙視角光片顯微鏡在這一領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展。本文探討了這一創(chuàng)新顯微鏡系統(tǒng)的功能和應(yīng)用。

腸類器官
利用光片顯微鏡對(duì)模擬腸道上皮的復(fù)雜結(jié)構(gòu)——腸類器官進(jìn)行成像，追蹤細(xì)胞動(dòng)態(tài)和分化過程。顯微鏡詳細(xì)展示了數(shù)天內(nèi)的隱窩和絨毛形成，為細(xì)胞周期動(dòng)態(tài)和類器官內(nèi)不同細(xì)胞類型成熟提供了見解。

圖一：

a.表達(dá)hGem-mVenus和hCdt1-mCherry的腸類器官（左），染色顯示溶菌酶（Lys）和DLL1（中）。

b.表達(dá)hCdt1-mCherry的腸類器官的最大投影圖（MIP），疊加了反向追蹤細(xì)胞的軌跡，以時(shí)間進(jìn)行顏色編碼。虛線對(duì)應(yīng)于z投影。

c.對(duì)腸類器官的檢測1、檢測2及融合數(shù)據(jù)的z投影，疊加了反向追蹤細(xì)胞的軌跡，顯示時(shí)間進(jìn)程。

d.腸隱窩的放大圖，星號(hào)表示同時(shí)陽性表達(dá)hCdt1、Dll1和溶菌酶的細(xì)胞。

e.單個(gè)細(xì)胞的hCdt1、溶菌酶和Dll1強(qiáng)度隨時(shí)間的定量分析：陽性隱窩細(xì)胞（e）；

f.陽性絨毛細(xì)胞（f）和陽性隱窩細(xì)胞（g）。

圖二：

e) 對(duì)在最后時(shí)間點(diǎn)位于隱窩中的三重陽性細(xì)胞（hCdt1、Dll1和溶菌酶）的hCdt1強(qiáng)度隨時(shí)間的量化。每種顏色代表一個(gè)單細(xì)胞（n = 4）。

f) 對(duì)在最后時(shí)間點(diǎn)位于絨毛中的hCdt1陽性細(xì)胞的hCdt1強(qiáng)度隨時(shí)間的量化。每種顏色代表一個(gè)單細(xì)胞（n = 7）。

g) 對(duì)在最后時(shí)間點(diǎn)位于隱窩中的hCdt1陽性細(xì)胞的hCdt1強(qiáng)度隨時(shí)間的量化。每種顏色代表一個(gè)單細(xì)胞（n = 9）。

 

文中對(duì)表達(dá)FUCCI2的腸類器官進(jìn)行了活體成像，并進(jìn)行了終點(diǎn)固定和免疫熒光評(píng)估其細(xì)胞類型組成。通過3D配準(zhǔn)將最后一個(gè)活體成像時(shí)間點(diǎn)與染色后的類器官疊加，使用Paneth細(xì)胞標(biāo)記溶菌酶（Lys）和分泌細(xì)胞標(biāo)記Dll1來檢測感興趣的細(xì)胞。三重陽性細(xì)胞（hCdt1+/Lys+/Dll1+）被反向追蹤以監(jiān)測Paneth細(xì)胞的成熟及其在G0/G1期的細(xì)胞周期停滯。成熟Paneth細(xì)胞的初始位置預(yù)測了類器官隱窩的最終位置。

 

接下來，比較了隱窩中的hCdt1+/Lys+/Dll1+ Paneth細(xì)胞與hCdt1+/Lys−/Dll−細(xì)胞（主要是腸干細(xì)胞）和類器官絨毛中的細(xì)胞（主要是腸細(xì)胞）。進(jìn)一步識(shí)別了那些在記錄開始前已經(jīng)終末分化的腸細(xì)胞和Paneth細(xì)胞。對(duì)于其他細(xì)胞，特別是在隱窩中的細(xì)胞，確定了它們出現(xiàn)的時(shí)間，從而能夠追蹤它們的完整成熟過程，固定時(shí)的平均細(xì)胞周期長度為21.9小時(shí)。評(píng)估細(xì)胞類型特定的出現(xiàn)時(shí)間，得出結(jié)論，Paneth細(xì)胞比單陽性hCdt1細(xì)胞出現(xiàn)得更早，表明特定的細(xì)胞周期長度和特定的分化順序。這種對(duì)細(xì)胞行為和成熟過程的洞見在沒有活體成像和免疫熒光結(jié)合整個(gè)類器官體積的情況下是無法實(shí)現(xiàn)的。

胚狀體

胚狀體是模擬早期胚胎發(fā)育的三維干細(xì)胞聚集體。光片顯微鏡捕捉到這些致密結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞分辨率圖像，揭示了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和形態(tài)變化。追蹤胚狀體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的能力突顯了光片顯微鏡在研究動(dòng)態(tài)發(fā)育過程中的應(yīng)用潛力。

圖三：

h. 表達(dá)Lck-GFP的胚體在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（42小時(shí)Wnt前期，66小時(shí)Wnt中期和90小時(shí)Wnt后期）的z平面圖像。

i. 在h中部分突出顯示的胚體細(xì)胞，分別為種植后42小時(shí)、66小時(shí)和90小時(shí)。箭頭指示細(xì)胞的突起。

j. 使用Cellpose軟件對(duì)種植后42小時(shí)的Lck-GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行的3D代表性分割。

k. 比較種植后42小時(shí)、66小時(shí)和90小時(shí)的細(xì)胞長軸和短軸的比率，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。

l. 胚體的最大投影圖（MIP），疊加了隨時(shí)間追蹤的細(xì)胞。

m. 細(xì)胞速度（μm/h）的小提琴圖，以觀察窗口分組，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。

n. 在42小時(shí)、66小時(shí)和90小時(shí)種植后拍攝的胚體細(xì)胞軌跡，中心對(duì)齊到坐標(biāo)系原點(diǎn)，并以顏色編碼表示時(shí)間進(jìn)程。

o. 在各個(gè)成像窗口中，Lck-GFP胚體細(xì)胞的軌跡長度。細(xì)胞速度（μm/h）的分組小提琴圖，圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。

p. Lck-GFP嵌合胚體在各個(gè)成像窗口中，所有細(xì)胞的平均均方位移（m.s.d.）。比例尺：50 μm（a–d, h, j, l）；20 μm（i）。

圖四：

h) 對(duì)懸浮狀態(tài)下成像的胚體在三個(gè)不同時(shí)間窗口中長軸和短軸比率的比較。測量在每個(gè)成像窗口（42小時(shí)、66小時(shí)或90小時(shí)）內(nèi)的3個(gè)胚體的3D體積上進(jìn)行，共33個(gè)時(shí)間點(diǎn)。分別對(duì)3753個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（42小時(shí)）、3340個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（66小時(shí)）和8861個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（90小時(shí)）進(jìn)行了分析。圖中顯示了中位數(shù)、第一和第三四分位數(shù)。

i) 胚體發(fā)育過程中在三個(gè)不同時(shí)間窗口內(nèi)成像的細(xì)胞速度的小提琴圖，顯示了中位數(shù)（圖中數(shù)值）及第一和第三四分位數(shù)。每個(gè)觀察窗口中追蹤的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量（來自3個(gè)單獨(dú)的胚體）如下：n = 622（42小時(shí)），n = 562（66小時(shí)），n = 539（90小時(shí)）。胚體在懸浮狀態(tài)下成像。

 

與其他樣本不同，胚狀體是密集結(jié)構(gòu)，因此難以單細(xì)胞分辨率成像。文中使用這個(gè)模型系統(tǒng)展示顯微鏡獲取單個(gè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和形態(tài)特征的能力。標(biāo)準(zhǔn)胚狀體實(shí)驗(yàn)方案使用Wnt激活劑（Chiron99021）以提高中胚層形成效率。這可能會(huì)誘導(dǎo)類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的行為并增加細(xì)胞遷移。為了分析胚狀體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)，文中生成了嵌合體，其中一部分細(xì)胞（約10%）表達(dá)膜報(bào)告基因（Lck-GFP）。記錄胚狀體在Wnt脈沖前、中和后的動(dòng)態(tài)。此外，將胚狀體嵌入40%的Matrigel中，以防止樣本腔室中的機(jī)械旋轉(zhuǎn)。使用Cellpose對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行3D分割，從而計(jì)算長軸/短軸比率，顯示細(xì)胞伸長在Chir處理期間達(dá)到峰值。

 

后期階段，部分細(xì)胞顯示出較長的細(xì)胞突起。這一觀察結(jié)果提出了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性在胚狀體發(fā)育過程中增加的假設(shè)。使用Fiji插件Mastodon，追蹤了Lck-GFP陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)遷移的中位速度在胚狀體發(fā)育過程中增加。在Wnt脈沖期間，遷移速度的中位數(shù)增加了1.4倍。Wnt激活后成像的胚體展示了最長的軌跡長度。對(duì)3D均方位移的評(píng)估表明，從90小時(shí)開始追蹤的細(xì)胞速度增加，并且遷移行為發(fā)生了變化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，遷移增加，提示W(wǎng)nt激活增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性并可能在胚體中促進(jìn)了協(xié)調(diào)遷移。觀察到的細(xì)胞形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)性增加，部分表明了類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。這一趨勢在嵌入Matrigel中的胚體和懸浮狀態(tài)下的胚體之間保持一致。

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡

 

設(shè)計(jì)和特點(diǎn)

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡結(jié)合了雙重照明和雙重檢測鏡頭，以實(shí)現(xiàn)多角度的高分辨率成像。其主要特點(diǎn)包括：

雙重照明和檢測

系統(tǒng)采用兩個(gè)相對(duì)的照明鏡頭和兩個(gè)檢測鏡頭，從不同方向捕捉圖像。這種配置最小化了偽影，特別適用于厚大標(biāo)本的高質(zhì)量成像。

開放式設(shè)計(jì)

這種設(shè)計(jì)允許從頂部輕松訪問樣本，便于在成像過程中進(jìn)行樣本操作和添加試劑。

多孔安裝系統(tǒng)

可定制的多孔樣本支架使得多樣本的高通量成像成為可能，這對(duì)于需要并行處理和比較的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

 

相較傳統(tǒng)顯微鏡的優(yōu)勢

 

高通量和低光毒性

光片顯微鏡通過薄光片照明樣本，固有地減少了光毒性，這對(duì)于長期的實(shí)時(shí)成像至關(guān)重要。雙視角設(shè)置在保持低光曝光的同時(shí)進(jìn)一步提升了圖像質(zhì)量。多孔系統(tǒng)允許同時(shí)成像多個(gè)樣本，與傳統(tǒng)顯微鏡方法相比顯著提高了通量。

 

 

詳細(xì)的單細(xì)胞分析

顯微鏡的高分辨率和雙視角功能使得在大而厚的樣本中進(jìn)行詳細(xì)的單細(xì)胞分析成為可能。這一特性對(duì)研究異質(zhì)生物過程尤其有價(jià)值，因?yàn)樾枰�在長時(shí)間內(nèi)觀察細(xì)胞行為和相互作用。

 

 

靈活性和定制化

開放式設(shè)計(jì)和可定制的樣本支架提供了處理不同類型樣本和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的靈活性。這種適應(yīng)性使顯微鏡適用于從類器官研究到發(fā)育生物學(xué)和癌癥研究的廣泛生物學(xué)研究。

 

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡代表了實(shí)時(shí)成像技術(shù)的重大進(jìn)展。未來的增強(qiáng)可能包括整合自適應(yīng)光學(xué)以進(jìn)一步提升圖像質(zhì)量，以及結(jié)合激光消融或光遺傳刺激技術(shù)以在成像過程中操縱樣本。此外，該系統(tǒng)處理光學(xué)透明標(biāo)本的能力可能擴(kuò)展其在深層組織成像中的應(yīng)用。

 

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡的開發(fā)和成功應(yīng)用標(biāo)志著生物成像領(lǐng)域的關(guān)鍵一步。通過在長時(shí)間內(nèi)提供大型多細(xì)胞系統(tǒng)的高分辨率三維圖像，這一技術(shù)為理解細(xì)胞水平上的復(fù)雜生物過程開辟了新的途徑。

 

閱讀原文：

Moos, F., Suppinger, S., de Medeiros, G. et al. Open-top multisample dual-view light-sheet microscope for live imaging of large multicellular systems. Nat Methods 21, 798–803 (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02213-w

 

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