穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）篩選方法及步驟介紹
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上，使細(xì)胞長期穩(wěn)定表達(dá)該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。慢病毒感染目的細(xì)胞后，通過抗性基因篩選得到的細(xì)胞株是多個細(xì)胞克隆的組合。單克隆細(xì)胞株是從多克隆細(xì)胞中經(jīng)細(xì)胞克隆挑選得到的，由一個細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株性狀統(tǒng)一，傳代過程中細(xì)胞的基因表達(dá)保持穩(wěn)定。
用轉(zhuǎn)染質(zhì)�；虿《厩秩镜姆椒▽�(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
穩(wěn)定細(xì)胞株是一種常用于基因表達(dá)、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達(dá)等領(lǐng)域的工具。但是，穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選需要經(jīng)過一系列的步驟和實驗，下面介紹一下穩(wěn)定細(xì)胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選簡要步驟：
一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標(biāo)志來篩選該細(xì)胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
1、篩選濃度測定，以10~14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
2、進(jìn)行細(xì)胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80% 覆蓋；
3、進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染
4、利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。
二、慢病毒轉(zhuǎn)染法：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的比較不錯的方式。
1、將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，
2、使用包裝細(xì)胞，一般為293細(xì)胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
3、用病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的病毒量。
4、后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
穩(wěn)定細(xì)胞株篩選步驟：
1、構(gòu)建攜帶目標(biāo)基因的載體
首先，需要將目標(biāo)基因克隆到攜帶有選擇標(biāo)記的載體中，例如含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒。然后將該載體轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中。
2、選擇標(biāo)記篩選
轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞需要在含有抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。只有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞才能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。
3、穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
在完成了選擇標(biāo)記篩選后，需要對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，以得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。這可以通過對細(xì)胞進(jìn)行單克隆分離來實現(xiàn)。具體地，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行單克隆分離，每個孔只保留一個細(xì)胞。然后，通過檢測細(xì)胞株的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，篩選出較佳的穩(wěn)定細(xì)胞株。
總結(jié)：
穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選是一個復(fù)雜的過程，需要仔細(xì)設(shè)計和實驗。通過上述步驟，可以篩選出高表達(dá)、穩(wěn)定的細(xì)胞株，為后續(xù)的實驗和研究提供了有力的支持。
用轉(zhuǎn)染質(zhì)�；虿《厩秩镜姆椒▽�(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上，得到單細(xì)胞長出的陽性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
穩(wěn)定細(xì)胞株是一種常用于基因表達(dá)、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達(dá)等領(lǐng)域的工具。但是，穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選需要經(jīng)過一系列的步驟和實驗，下面介紹一下穩(wěn)定細(xì)胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選簡要步驟：
一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標(biāo)志來篩選該細(xì)胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
1、篩選濃度測定，以10~14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
2、進(jìn)行細(xì)胞接種，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80% 覆蓋；
3、進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染
4、利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。
二、慢病毒轉(zhuǎn)染法：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的比較不錯的方式。
1、將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，
2、使用包裝細(xì)胞，一般為293細(xì)胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
3、用病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的病毒量。
4、后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。
穩(wěn)定細(xì)胞株篩選步驟：
1、構(gòu)建攜帶目標(biāo)基因的載體
首先，需要將目標(biāo)基因克隆到攜帶有選擇標(biāo)記的載體中，例如含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒。然后將該載體轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中。
2、選擇標(biāo)記篩選
轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞需要在含有抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。只有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞才能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。
3、穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
在完成了選擇標(biāo)記篩選后，需要對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，以得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。這可以通過對細(xì)胞進(jìn)行單克隆分離來實現(xiàn)。具體地，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行單克隆分離，每個孔只保留一個細(xì)胞。然后，通過檢測細(xì)胞株的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，篩選出較佳的穩(wěn)定細(xì)胞株。
總結(jié)：
穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選是一個復(fù)雜的過程，需要仔細(xì)設(shè)計和實驗。通過上述步驟，可以篩選出高表達(dá)、穩(wěn)定的細(xì)胞株，為后續(xù)的實驗和研究提供了有力的支持。
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