熒光顯微成像具有高分辨率、高靈敏度、高分子特異性以及非介入性的優(yōu)點，可以在微米乃至納米尺度下表征樣本的形態(tài)學(xué)與分子功能學(xué)信息，成為了生命科學(xué)研究的重要工具。

隨著微觀生物學(xué)研究的不斷深入，熒光顯微成像被期待能夠動態(tài)且立體地觀測微觀生物結(jié)構(gòu)與分子事件。

西安電子科技大學(xué)的閆天宇、何穎團(tuán)隊在《紅外與激光工程》發(fā)表文章《快速三維熒光顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展（特邀）》，系統(tǒng)性地梳理了近年來快速三維熒光顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展，并展望了快速三維熒光顯微成像技術(shù)的未來挑戰(zhàn)與發(fā)展前景。

點掃描式三維熒光顯微成像技術(shù)

技術(shù)原理與應(yīng)用
使用具有層析能力的熒光顯微鏡逐層成像獲得圖像堆棧，以CLSM和TPM為代表的掃描式顯微鏡具有更高的穿透深度、成像信噪比和光學(xué)切片能力，常用于細(xì)胞成像、在體組織成像、腦神經(jīng)元研究等領(lǐng)域。

如Zhu等人使用自行合成的近紅外二區(qū)造影劑在CLSM系統(tǒng)中實現(xiàn)對腦組織切片的三維體積成像；Yang等人將雙光子光遺傳學(xué)與雙光子鈣體積成像相結(jié)合進(jìn)行在體三維測量和操縱小鼠大腦皮層的神經(jīng)活動。

提高成像速度的方法
1、減少掃描維度：早期的線掃描策略可從一個方向屏蔽焦外信號，但會降低成像質(zhì)量，提高機(jī)械掃描組件掃描轉(zhuǎn)子的頻率可獲得更高的掃描速度。如Piyawattanametha等人開發(fā)的二維單晶硅掃描鏡用于TPM和顯微內(nèi)窺鏡中，Boutilier等人通過安裝多面鏡提高TPM水平方向上的快軸掃描速度。

2、多焦點并行掃描：同時偏轉(zhuǎn)復(fù)數(shù)個光束進(jìn)行多焦點并行式高速掃描。如Zhang等人使用掃描振鏡和微透鏡陣列實現(xiàn)400個焦點的并行式掃描，或使用轉(zhuǎn)盤式掃描顯微鏡，如Oketani等人使用針孔陣列盤作為掃描單元進(jìn)行快速成像。

3、時間延遲多焦點掃描：基于時間延遲的多路復(fù)用的多焦點掃描技術(shù)，允許高速高靈敏度的單點探測器采集多焦點的時間信號序列進(jìn)行圖像重構(gòu)。如Wu等人在TPM中令非平行的脈沖激光束在反射鏡之間多次反射以分離不同波矢方向的子脈沖，配合一維掃描振鏡與光電倍增管實現(xiàn)快速采樣。

4、提升軸向掃描效率：將變焦透鏡引入成像系統(tǒng)通過高速變焦進(jìn)行軸向快速掃描。如Chien將軸向掃描頻率高達(dá)1MHz的可調(diào)諧聲學(xué)梯度指數(shù)鏡頭應(yīng)用于雙光子顯微鏡中，或在照明光路中設(shè)置可沿光軸方向快速移動的反射鏡結(jié)合多路復(fù)用技術(shù)，也可利用貝塞爾光等無衍射光束實現(xiàn)快速體積成像。

增強空間分辨率的方法
利用多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡、4Pi顯微鏡技術(shù)、受激輻射損耗顯微鏡等可實現(xiàn)超分辨三維成像，如York等人開發(fā)的多焦點結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡獲得了145nm的橫向分辨率，Velasco等人結(jié)合雙光子照明、自適應(yīng)光學(xué)和近紅外熒光探針等技術(shù)獲得了深度可達(dá)164μm的三維超分辨熒光顯微圖像。

存在的問題
提高掃描速度會導(dǎo)致單個采樣點的光子產(chǎn)量及曝光時間下降，對光子預(yù)算的規(guī)劃要求更為嚴(yán)格，系統(tǒng)的復(fù)雜化會導(dǎo)致成本提高。此外，超分辨技術(shù)應(yīng)權(quán)衡分辨率、視野和成像時間之間的關(guān)系。

寬場式三維熒光顯微成像技術(shù)
光片熒光顯微鏡
技術(shù)原理與優(yōu)勢
采用薄片狀的照明光源替代常規(guī)顯微鏡中的柱形光源，只有在光片內(nèi)部的熒光分子被高效率激發(fā)，產(chǎn)生較少的焦外信號，提高了圖像對比度，且大幅度降低了對生物樣本的光毒性，在橫向上可由面陣探測器直接成像，采集圖像堆棧只需執(zhí)行一個維度的掃描，適合長時間實時成像。

如Liu等人將晶格光片顯微鏡與自適應(yīng)光學(xué)相結(jié)合實現(xiàn)對大體積多細(xì)胞樣本中亞細(xì)胞過程的無創(chuàng)無像差成像，F(xiàn)ei等人將像素超分辨技術(shù)加入到光片顯微鏡中實現(xiàn)對大體積樣本的各向同性的高分辨率成像。

提高成像速度的方法
基于振鏡和可變焦透鏡的高速掃描策略可用于光片顯微鏡中，如Fahrbach等人利用透鏡掃描實現(xiàn)對跳動的斑馬魚心臟內(nèi)的平面進(jìn)行快速成像；Haslehurst等人在光片顯微鏡中加入振鏡進(jìn)行快速軸向掃描并配合電控可調(diào)諧鏡頭同步采集圖像；擴(kuò)展景深也可提高成像速度，如Lin等人通過將軸棱錐加入到雙光子光片熒光顯微鏡中產(chǎn)生拓展景深，Olarte等人通過使用波前編碼技術(shù)在光片顯微鏡中擴(kuò)展檢測光學(xué)器件景深；

此外，單物鏡式光片顯微鏡被開發(fā)出來，如Yang等人在落射式熒光顯微鏡中生成傾斜的光片并在像方光路選擇區(qū)別于照明光路的視野實現(xiàn)單物鏡光片顯微鏡，Cai等人在落射式熒光顯微鏡中生成沿軸向傳播的光片照明并設(shè)置微鏡陣列配合一維掃描實現(xiàn)單物鏡、正入射式的光片顯微鏡。

光場熒光顯微鏡
技術(shù)原理與存在的問題：通過在像方光路中設(shè)置微透鏡陣列的方式同時獲取光的強度和角度信息，可在不執(zhí)行掃描的條件下重建樣本的三維信息，具有天然的速度優(yōu)勢，但三維成像能力以犧牲橫向分辨率為代價，且在三維視場上的分辨率不均勻。

提高分辨率的方法：通過反卷積的圖像重建方法、數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)掃描光場相互迭代斷層掃描的計算成像框架、在光路中加入衍射光學(xué)元件等可增強分辨率。如Prevedel等人通過反卷積的圖像重建方法獲得了1.4μm的有效分辨率，Wu等人提出的計算成像框架將光場顯微鏡的橫向分辨率和軸向分辨率分別提升至了220nm和400nm，Pan等人通過在樣品和顯微鏡物鏡之間插入透射式光柵提升軸向分辨率，He等人通過在光場顯微鏡的傅里葉平面上放置衍射光學(xué)元件實現(xiàn)一種快照多焦光場顯微成像方法獲得較大的場深。

提高成像速度的方法：使用兩個互相垂直的物鏡同時獲取正交光場進(jìn)行雙視圖數(shù)據(jù)融合并反卷積、利用高分辨率的二維圖像和低分辨率的四維光場圖像通過反卷積和相位恢復(fù)的混合算法、結(jié)合光場顯微鏡與深度學(xué)習(xí)成像技術(shù)等可提高成像速度。

如Wagner等人使用兩個互相垂直的物鏡實現(xiàn)高達(dá)200Hz的無運動偽影體積成像，Geng等人利用混合算法將圖像重建的計算速度提高了4倍，Wang等人結(jié)合光場顯微鏡與深度學(xué)習(xí)成像技術(shù)實現(xiàn)對跳動的斑馬魚心臟中的血流進(jìn)行成像，體積成像速率也達(dá)到了200Hz。

提高圖像質(zhì)量的方法：光場顯微鏡可和其他先進(jìn)照明策略結(jié)合以提升圖像質(zhì)量，如Truong等人構(gòu)建基于光場的選擇性體積照明顯微鏡降低背景噪聲并獲得分辨率增強效果，Wang等人將光片照明技術(shù)應(yīng)用于光場顯微鏡使其成像對比度增強、信噪比提升，Zhang等人將共焦檢測方案與光場顯微鏡結(jié)合獲取光學(xué)切片能力以及提高成像深度。

寬場超分辨顯微鏡
結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像：通過對樣本施加干涉條紋并相移來實現(xiàn)樣本圖像的超分辨率重建，二維結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)只能提升橫向分辨率，三維結(jié)構(gòu)光可重建出樣本的三維超分辨率熒光圖像，但對像差敏感，成像深度有限。通過將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)引入到三維結(jié)構(gòu)光照明成像中可消除像差，提高成像深度，如Lin等人通過將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)引入到三維結(jié)構(gòu)光照明成像中成功將其成像深度提高至80μm。

單分子定位超分辨成像：對視野內(nèi)的熒光分子進(jìn)行稀疏性激發(fā)，使臨近的熒光分子不同時發(fā)光，進(jìn)而允許在每次成像時對零散的熒光分子以納米級精度定位，成像進(jìn)行成千上萬次即可重構(gòu)出一張超分辨圖像�；�于單分子定位的成像技術(shù)已被證明可以在橫向和軸向均獲得超分辨率能力，且可通過適用于單分子定位的盲修復(fù)圖像重建方法降低對數(shù)據(jù)量的要求，提高成像速度，如莊小威等人提出的三維單分子定位超分辨成像方案實現(xiàn)了橫向 30nm、軸向60nm的單分子定位精度，莊小威等人在2011年以類似的分辨率實現(xiàn)了0.5Hz的體積成像速率，Wang等人提出的盲修復(fù)圖像重建方法可從低密度圖像中恢復(fù)精細(xì)結(jié)構(gòu)并提高成像速度。

光學(xué)漲落超分辨成像：通過捕捉獨立分布的熒光分子的閃爍狀態(tài)而實現(xiàn)分辨率增強，可直接使用寬場熒光顯微鏡采集的時間圖像序列完成超分辨圖像重建，具有低成本、適用廣泛的優(yōu)點，但分辨率提升效果受限于探測器像素尺寸，可通過基于傅里葉變換的插值方案突破像素尺寸的限制，提高分辨率增強的上限，如Stein等人提出的基于傅里葉變換的插值方案可重建出像素密度更高的圖像且不會引入偽影。

寬場式三維熒光顯微成像在克服傳統(tǒng)寬場顯微鏡缺陷的同時，憑借更低的光毒性以及數(shù)據(jù)采集維度的優(yōu)勢，成為了實時體積成像的強有力工具，允許科研人員對微觀視野下短暫的分子事件進(jìn)行動態(tài)追蹤。超分辨技術(shù)的加入則使得寬場顯微成像可以在時間分辨率和空間分辨率之間進(jìn)行取舍。

投影斷層式三維熒光顯微成像技術(shù)

技術(shù)原理
類似于使用X射線的計算機(jī)斷層掃描，在光學(xué)波段對樣本進(jìn)行多角度彈道式照明獲取投影數(shù)據(jù)集可以對樣本實現(xiàn)三維斷層重建，即光學(xué)投影斷層成像技術(shù)（OPT）。

應(yīng)用與優(yōu)勢
OPT已被證明可以用于某些光學(xué)透明度較高的活體生物進(jìn)行全身斷層重建，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，可對生物樣本內(nèi)部的光吸收和熒光信號進(jìn)行三維追蹤。

如Bassi等人利用OPT技術(shù)以無標(biāo)記的形式實現(xiàn)對弱散射活體樣本的血管網(wǎng)絡(luò)的可視化與三維斷層重建；Arranz等人利用OPT技術(shù)對黑腹果蠅蛹進(jìn)行三維斷層掃描并捕捉到蛹內(nèi)頭部外翻過程的體積圖像；McGinty等人使用綠色熒光蛋白標(biāo)記斑馬魚胚胎后成功對其進(jìn)行包含熒光壽命信息的光學(xué)投影斷層掃描。

相比于點掃描需要對樣本進(jìn)行數(shù)百萬至數(shù)千萬次采樣才能重建出三維圖像，結(jié)合OPT技術(shù)的三維熒光顯微成像僅需獲得數(shù)百個不同角度的投影即可完成采樣并斷層重建，并且可以檢測厚度在毫米量級的樣本。

提高成像速度的方法
1、減少數(shù)據(jù)采集時間：開發(fā)樣品在旋轉(zhuǎn)軸上的半自動精確定位方法，并結(jié)合數(shù)據(jù)采集后的自動校正算法，可減少數(shù)據(jù)采集時間并提高重建后的圖像質(zhì)量，如Cheddad等人開發(fā)的定位方法獲得了0.01pixel的校正精度。

2、提高重建時對數(shù)據(jù)的利用效率：采用基于調(diào)制傳遞函數(shù)的頻率截止濾波器作為重建時的附加濾波器，可在抑制重建偽影的同時降低對數(shù)據(jù)量的要求，提高數(shù)據(jù)采集速度，如Chen等人采用該濾波器將數(shù)據(jù)采集速度提高了4倍。

4、開發(fā)適用于有限角度投影以及稀疏投影的重建方法：基于各項異性全變分極小化的重建方法可在重建有限角度的投影數(shù)據(jù)時獲得明顯優(yōu)于經(jīng)典方法的圖像質(zhì)量。

如Chen等人提出的該重建方法；結(jié)合代數(shù)重建與先驗信息的方法可減少采集投影的范圍；如Wang等人通過優(yōu)化樣本固定方式提高活體樣本的縱向檢測能力并結(jié)合代數(shù)重建與先驗信息的方法僅需采集130°范圍內(nèi)的投影即可重建出質(zhì)量可接受的圖像；基于稀疏視圖數(shù)據(jù)的稀疏重建方案結(jié)合代數(shù)重建和全變分正則化的迭代重建方法，可減少用于重建的投影數(shù)量，如Chen等人提出的該方案用于重建的投影數(shù)量可降低至15個；基于兩階段深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)的框架用于稀疏投影的重建與去噪，可進(jìn)一步減少所需的投影數(shù)量，如Wang等人提出的該框架可將所需的投影數(shù)量進(jìn)一步降低至9個。

存在的問題
OPT技術(shù)對樣本的光學(xué)透過率要求較高，對于不透明的樣本需要先進(jìn)行透明化預(yù)處理，因此可以檢測的活體樣本的種類有限，并會丟失在透明化處理中被去除的生物信息。

總結(jié)與展望
現(xiàn)有技術(shù)方案在一定程度上已經(jīng)允許對部分微觀尺度上的生物分子事件進(jìn)行三維動態(tài)跟蹤，但仍存在一些因素在限制實時體積成像的進(jìn)一步發(fā)展，包括數(shù)據(jù)處理的實時性較差、光學(xué)顯微成像的深度受限、視場有限以及基于熒光標(biāo)記的顯微成像技術(shù)難以描述樣本的全部分子事件等。

隨著各種先進(jìn)光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展與融合，實時三維光學(xué)顯微成像將會有進(jìn)一步突破，提供更加完善的微觀生物信息。

內(nèi)容來源：
閆天宇,何穎,王鑫宇,徐欣怡,謝暉,陳雪利.快速三維熒光顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展（特邀）[J].紅外與激光工程,2022,51(11):20220546.Tianyu Yan,Ying He,Xinyu Wang,Xinyi Xu,Hui Xie,Xueli Chen.Research progress on fast 3D fluorescence microscopic imaging (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220546.