細(xì)胞培養(yǎng)生物污染的種類及預(yù)防方法
無論新人還是老手，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中都可能遇到細(xì)胞污染的情況。那對于細(xì)胞污染，最重要的是預(yù)防，因?yàn)榧?xì)胞一旦污染，想救是非常困難的，即便救活，細(xì)胞狀態(tài)也會變差，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以先來講講如何預(yù)防。
無論新人還是老手，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中都可能遇到細(xì)胞污染的情況。那對于人源細(xì)胞或鼠源細(xì)胞的污染，最重要的是預(yù)防，因?yàn)榧?xì)胞一旦污染，想救是非常困難的，即便救活，細(xì)胞狀態(tài)也會變差，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以先來講講如何預(yù)防。生物安全柜是細(xì)胞處理的主要場所，而培養(yǎng)箱是細(xì)胞生長的主要場所，所以細(xì)胞污染通常就發(fā)生在這兩個(gè)地方。那么在使用生物安全柜和培養(yǎng)箱時(shí)如何做好預(yù)防措施呢？
首先，所有進(jìn)入安全柜的東西都要盡可能保證無菌。如果實(shí)驗(yàn)室條件允許，那直接購買商品化的試劑和耗材是最穩(wěn)妥的，例如Gibco、Hyclone的試劑，Eppendorf、Corning的耗材，這些大品牌的試劑和耗材一般只要是正品都可以保證無菌。如果試劑需要自己用干粉配制，那么在配制中需要嚴(yán)格按無菌操作進(jìn)行。另外每次試劑配制量不宜過多，比如完全培養(yǎng)基建議以一到兩周內(nèi)用完為宜。試劑在分裝時(shí)可以考慮再用針頭式過濾器過濾一次，減少污染的可能性。如果所用移液器吸頭是散裝的，則注意在將吸頭裝入吸頭盒時(shí)需要帶手套，因?yàn)闇缇鷷r(shí)無法完全去除吸頭上可能粘附的油脂和其他雜質(zhì)。
其次，安全柜每次使用前需要紫外照射30min滅菌，然后通風(fēng)5min以上保證換氣到位。每次處理細(xì)胞前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)需要的各種試劑、耗材備齊，盡量減少細(xì)胞處理過程中的來回走動。安全柜內(nèi)的東西盡量擺放有序，具體可以根據(jù)個(gè)人使用習(xí)慣而定，如果你使用的是公用安全柜，則可能需要使用前臨時(shí)調(diào)整。以個(gè)人為例，移液器和吸頭盒放右手邊，實(shí)驗(yàn)中常用試劑放右前方，廢液缸放左前方，并保證和試劑有一定安全距離，右角放置培養(yǎng)皿，左角放置其他耗材。大致原則是盡量保證最常用的東西靠右，次常用的東西靠左，右邊操作區(qū)域?yàn)闈崈魠^(qū)，左邊操作區(qū)域?yàn)榉菨崈魠^(qū)，左撇則相反。
然后，實(shí)驗(yàn)過程中所有試劑不用時(shí)需要蓋上瓶蓋，瓶蓋打開時(shí)除了干凈的吸頭，其他任何東西都不要從瓶口的上方經(jīng)過。如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，則處理時(shí)不要長時(shí)間打開皿蓋。如果所用吸頭沒有濾芯，那在使用時(shí)注意不要將試劑倒吸入移液器，如果倒吸的是培養(yǎng)基，極易成為細(xì)菌生長的溫床。一把有菌的移液器可以輕松污染所有使用其處理過的細(xì)胞，所以一旦發(fā)生倒吸，要及時(shí)用酒精棉球擦去倒吸的試劑，有條件的建議使用帶濾芯的吸頭。由于使用安全柜的過程中手和前臂都要進(jìn)入安全柜，所以有條件的可以準(zhǔn)備一件細(xì)胞房專用無塵服，使用前裝入布袋消毒后烘干，在細(xì)胞房中取出，非更換前不要穿出細(xì)胞房。沒有條件的則可以準(zhǔn)備一副袖套，每次用完后放安全柜中紫外消毒。無論是否穿戴無塵服或者袖套，實(shí)驗(yàn)過程中只要手出了安全柜，再進(jìn)入前都需要用75%的酒精消毒。
最后，如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱前搖勻時(shí)要輕柔，不要將培養(yǎng)基搖到皿蓋和皿身的間隙中，這樣在細(xì)胞生長時(shí)很容易污染。如果使用瓶蓋沒有氣孔的細(xì)胞瓶培養(yǎng)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱前需要將瓶蓋擰松半圈左右，保證瓶內(nèi)外可以進(jìn)行氣體交換，注意不要擰太松，這樣在細(xì)胞生長時(shí)也很容易污染，有條件的建議選擇瓶蓋有氣孔的細(xì)胞瓶，這樣放入培養(yǎng)箱前直接擰緊瓶蓋即可。由于培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和濕度很高，所以最好定期用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱消毒。培養(yǎng)箱里水槽中的水需要使用無菌水，不可以用自來水。
無論新人還是老手，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中都可能遇到細(xì)胞污染的情況。那對于人源細(xì)胞或鼠源細(xì)胞的污染，最重要的是預(yù)防，因?yàn)榧?xì)胞一旦污染，想救是非常困難的，即便救活，細(xì)胞狀態(tài)也會變差，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以先來講講如何預(yù)防。生物安全柜是細(xì)胞處理的主要場所，而培養(yǎng)箱是細(xì)胞生長的主要場所，所以細(xì)胞污染通常就發(fā)生在這兩個(gè)地方。那么在使用生物安全柜和培養(yǎng)箱時(shí)如何做好預(yù)防措施呢？
首先，所有進(jìn)入安全柜的東西都要盡可能保證無菌。如果實(shí)驗(yàn)室條件允許，那直接購買商品化的試劑和耗材是最穩(wěn)妥的，例如Gibco、Hyclone的試劑，Eppendorf、Corning的耗材，這些大品牌的試劑和耗材一般只要是正品都可以保證無菌。如果試劑需要自己用干粉配制，那么在配制中需要嚴(yán)格按無菌操作進(jìn)行。另外每次試劑配制量不宜過多，比如完全培養(yǎng)基建議以一到兩周內(nèi)用完為宜。試劑在分裝時(shí)可以考慮再用針頭式過濾器過濾一次，減少污染的可能性。如果所用移液器吸頭是散裝的，則注意在將吸頭裝入吸頭盒時(shí)需要帶手套，因?yàn)闇缇鷷r(shí)無法完全去除吸頭上可能粘附的油脂和其他雜質(zhì)。
其次，安全柜每次使用前需要紫外照射30min滅菌，然后通風(fēng)5min以上保證換氣到位。每次處理細(xì)胞前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)需要的各種試劑、耗材備齊，盡量減少細(xì)胞處理過程中的來回走動。安全柜內(nèi)的東西盡量擺放有序，具體可以根據(jù)個(gè)人使用習(xí)慣而定，如果你使用的是公用安全柜，則可能需要使用前臨時(shí)調(diào)整。以個(gè)人為例，移液器和吸頭盒放右手邊，實(shí)驗(yàn)中常用試劑放右前方，廢液缸放左前方，并保證和試劑有一定安全距離，右角放置培養(yǎng)皿，左角放置其他耗材。大致原則是盡量保證最常用的東西靠右，次常用的東西靠左，右邊操作區(qū)域?yàn)闈崈魠^(qū)，左邊操作區(qū)域?yàn)榉菨崈魠^(qū)，左撇則相反。
然后，實(shí)驗(yàn)過程中所有試劑不用時(shí)需要蓋上瓶蓋，瓶蓋打開時(shí)除了干凈的吸頭，其他任何東西都不要從瓶口的上方經(jīng)過。如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，則處理時(shí)不要長時(shí)間打開皿蓋。如果所用吸頭沒有濾芯，那在使用時(shí)注意不要將試劑倒吸入移液器，如果倒吸的是培養(yǎng)基，極易成為細(xì)菌生長的溫床。一把有菌的移液器可以輕松污染所有使用其處理過的細(xì)胞，所以一旦發(fā)生倒吸，要及時(shí)用酒精棉球擦去倒吸的試劑，有條件的建議使用帶濾芯的吸頭。由于使用安全柜的過程中手和前臂都要進(jìn)入安全柜，所以有條件的可以準(zhǔn)備一件細(xì)胞房專用無塵服，使用前裝入布袋消毒后烘干，在細(xì)胞房中取出，非更換前不要穿出細(xì)胞房。沒有條件的則可以準(zhǔn)備一副袖套，每次用完后放安全柜中紫外消毒。無論是否穿戴無塵服或者袖套，實(shí)驗(yàn)過程中只要手出了安全柜，再進(jìn)入前都需要用75%的酒精消毒。
最后，如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱前搖勻時(shí)要輕柔，不要將培養(yǎng)基搖到皿蓋和皿身的間隙中，這樣在細(xì)胞生長時(shí)很容易污染。如果使用瓶蓋沒有氣孔的細(xì)胞瓶培養(yǎng)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱前需要將瓶蓋擰松半圈左右，保證瓶內(nèi)外可以進(jìn)行氣體交換，注意不要擰太松，這樣在細(xì)胞生長時(shí)也很容易污染，有條件的建議選擇瓶蓋有氣孔的細(xì)胞瓶，這樣放入培養(yǎng)箱前直接擰緊瓶蓋即可。由于培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和濕度很高，所以最好定期用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱消毒。培養(yǎng)箱里水槽中的水需要使用無菌水，不可以用自來水。
那么細(xì)胞如果還是不幸污染了又該怎么辦呢？把細(xì)胞污染分為早期污染和晚期污染兩種情況。早期污染是細(xì)胞狀態(tài)變差，但依舊能保持生長，顯微鏡下未見明顯微生物或可見少量微生物。這種情況的話我們在換液時(shí)可以多用PBS洗幾次，然后加入適合的抗生素。早期污染只要發(fā)現(xiàn)及時(shí)，處理得當(dāng)，救回來的可能性還是很大的。晚期污染則是細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞停止生長，顯微鏡下可見大量微生物。這時(shí)候建議大家及時(shí)清理掉相關(guān)細(xì)胞，以免污染其他細(xì)胞。在對安全柜和培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒后，再重新復(fù)蘇早批次的細(xì)胞。細(xì)心的會發(fā)現(xiàn)，新細(xì)胞收到后，不應(yīng)急于開展實(shí)驗(yàn)，而應(yīng)該先小心培養(yǎng)，凍存一到兩個(gè)批次的細(xì)胞后再開展實(shí)驗(yàn)，這樣實(shí)驗(yàn)過程中如果細(xì)胞出現(xiàn)問題，可以有凍存細(xì)胞保證實(shí)驗(yàn)還能繼續(xù)進(jìn)行。
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