▲PyroSmart NextGen®重組鱟試劑

科德角國(guó)際的合作企業(yè)美國(guó)ACC公司（Associates Of Cape Cod）自2021年起，推出了PyroSmart NextGen®重組級(jí)聯(lián)試劑(rCR)，標(biāo)志著細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET）領(lǐng)域的一次重大革新。

為了響應(yīng)《美國(guó)藥典-國(guó)家處方集》（USP-NF）收錄第<86>章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試”，研究團(tuán)隊(duì)使用PyroSmart NextGen®重組鱟試劑（PSNG）對(duì)替代細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試方法進(jìn)行了一系列的驗(yàn)證。
 

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET）是一項(xiàng)關(guān)鍵的質(zhì)量控制流程，利用從鱟血液中提取的鱟變形細(xì)胞裂解物（LAL）試劑，有效檢測(cè)和量化腸外藥品及醫(yī)療器械中的革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素。

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑(PSNG)是市場(chǎng)上第一款完整的重組級(jí)聯(lián)試劑(rCR)，包含重組C因子、重組B因子、重組凝固酶原。該試劑的核心優(yōu)勢(shì)在于其徹底消除了LAL試劑批次間的差異性，并避免了因（1→3）-β-D-葡聚糖凝結(jié)途徑誤觸發(fā)的假陽(yáng)性問(wèn)題。此外，采用重組鱟試劑還符合動(dòng)物福利保護(hù)的原則，推動(dòng)了細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展。
 

▲PyroSmart NextGen®重組鱟試劑

在美國(guó)，重組試劑被認(rèn)為是藥典LAL試劑的替代品，因此，將這些重組試劑⽤于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)需要進(jìn)⾏驗(yàn)證，以證明結(jié)果等于或優(yōu)于LAL試劑測(cè)定的結(jié)果。

本研究通過(guò)一系列分析性能評(píng)估，包括線性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)范圍、定量限及特異性等，依據(jù)USP<1225>和ICH Q2指南，對(duì)PyroSmart NextGen®（重組鱟試劑）、Pyrochrome®（顯色法鱟試劑）及Pyrotell®-T（濁度法鱟試劑）根據(jù)內(nèi)部驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了全面比較，證實(shí)了其等效性。

▲Pyrochrome®（顯色法鱟試劑）

▲Pyrotell®-T（濁度法鱟試劑）

此外，還使用PyroSmart NextGen® 和兩種LAL試劑對(duì)三個(gè)批次的腸外藥物樣品進(jìn)行了測(cè)試，以便根據(jù)USP<1085> 和USP<85> 直接比較方法適用性結(jié)果。這一過(guò)程嚴(yán)格遵循了USP<1085>和USP<85>的標(biāo)準(zhǔn)，旨在通過(guò)實(shí)際樣品測(cè)試來(lái)驗(yàn)證并對(duì)比各方法在檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素方面的適用性結(jié)果。

一、方法和結(jié)果
1、PyroSmart NextGen® 的分析性能（非產(chǎn)品特定方法驗(yàn)證測(cè)試）
使⽤PyroSmart NextGen®定量的所有標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和三個(gè)單獨(dú)制備的USP-RSE（美國(guó)藥典參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素）濃度均滿⾜線性、準(zhǔn)確度、精密度、范圍和定量限規(guī)范（表1和表2）。因此，PyroSmart NextGen®的分析性能符合 USP<1225>和ICH Q2準(zhǔn)則的規(guī)定。
 

2、PyroSmart NextGen® 的方法適用性（產(chǎn)品特定測(cè)試）
使⽤三種PPC（陽(yáng)性產(chǎn)物對(duì)照）濃度測(cè)試的三批注射用檸檬酸鈉滿足線性、準(zhǔn)確度、精密度、范圍、定量限、特異性和穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)（表3和表4）。根據(jù) USP<1085> 、USP<85> 、USP<1225> 和ICH Q2指南（雜質(zhì)定量測(cè)試），PyroSmart NextGen®的產(chǎn)品特定⽅法適⽤性已得到證明。
 

3、PyroSmart NextGen®和LAL試劑的等效性測(cè)試
Pyrochrome®和Pyrotell®-T產(chǎn)生的結(jié)果均符合分析性能和方法適用性的內(nèi)部驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。將LAL試劑與PyroSmart NextGen®直接比較表明，PyroSmart NextGen®在所有參數(shù)上均具有相同或更好的結(jié)果（表 1-表4）。

4、PyroSmart NextGen®的精密度
額外的精確度分析表明，PyroSmart NextGen®的最大變異系數(shù)為20.89%，而Pyrochrome®的最大變異系數(shù)為23.22%，Pyrotell®-T的最大變異系數(shù)為29.24%（圖1）。這表明PyroSmart NextGen®在重復(fù)性測(cè)試中具有更高的穩(wěn)定性和可靠性。
 

▲圖1

所有含有可檢測(cè)（在本例中為添加）內(nèi)毒素的樣品（三個(gè)單獨(dú)制備的USP-RSE濃度和注射用檸檬酸鈉樣品PPC）的相對(duì)回收率結(jié)果均在50-200%范圍內(nèi)（圖2）。
 

▲圖2  

二、結(jié)論
PyroSmart NextGen®展現(xiàn)出卓越的性能，能夠有效從各類干擾藥物中回收內(nèi)毒素，其回收率與傳統(tǒng)的LAL試劑相當(dāng)。在針對(duì)如注射用檸檬酸鈉等多種產(chǎn)品的測(cè)試中，PyroSmart NextGen®在產(chǎn)品特定的方法適用性數(shù)據(jù)中符合準(zhǔn)確性和精密度要求。

依據(jù)USP<1225>及ICH Q2雜質(zhì)定量檢測(cè)指南，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)PyroSmart NextGen®進(jìn)行了包括線性、范圍、定量限、特異性和穩(wěn)定性在內(nèi)的全面分析評(píng)估，所有結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)，PyroSmart NextGen®具備全面的分析能力。

作為一種先進(jìn)的重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR），PyroSmart NextGen®完全符合所有內(nèi)部驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，且在測(cè)試多種類型樣品時(shí)，其表現(xiàn)等同于或優(yōu)于天然來(lái)源的LAL試劑，為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的替代方案。