近些年，生物3D打印技術(shù)廣泛應(yīng)用于皮膚組織修復(fù)工程，即利用如膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、果膠、透明質(zhì)酸和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix ，ECM）等各種不同的生物墨水，開(kāi)發(fā)和人體皮膚具有類似甚至相同機(jī)械特性、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性的人造皮膚，將其用于創(chuàng)傷修復(fù)、藥物開(kāi)發(fā)和基礎(chǔ)研究等。然而，現(xiàn)有生物墨水所構(gòu)建的人造皮膚無(wú)法滿足實(shí)際應(yīng)用要求。

 

葡萄牙波爾圖大學(xué)衛(wèi)生和創(chuàng)新研究所的科研團(tuán)隊(duì)于2024年在《Biomimetics》雜志發(fā)表了文章《Bioinspired and Photo-Clickable Thiol-Ene Bioinks for the Extrusion Bioprinting of Mechanically Tunable 3D Skin Models》。在該文中，作者利用果膠、多肽、甲基丙烯酸、CaCl2、人成纖維細(xì)胞作為生物墨水材料，構(gòu)建了一種新型皮膚細(xì)胞模型，并測(cè)試機(jī)械性能、組織相容性等指標(biāo)，為開(kāi)發(fā)更理想的人造皮膚提供了新的研究依據(jù)。

1. 以果膠作為主要成分構(gòu)建生物墨水

果膠是一種具有優(yōu)異組織相容性的天然多糖，添加不同比例的甲基丙烯酸酯后形成甲基丙烯酸果膠（pectin methacrylate，PECMA）。PECMA可以與特定肽序列中的半胱氨酸殘基在光照的情況下發(fā)生硫醇-烯反應(yīng)光交聯(lián)；另一方面和CaCl2中的鈣離子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)離子交聯(lián)，對(duì)墨水流變性能進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到與天然真皮類似的機(jī)械性能。（圖1 a和b）

2. 將制備好的PECMA和人的真皮成纖維細(xì)胞混合為待打印的生物墨水，通過(guò)西班牙Regemat 3D公司的Bio V1 3D生物打印機(jī)，按預(yù)先設(shè)定程序打印成特定結(jié)構(gòu)，并在紫外光下交聯(lián)40秒，形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)與皮膚類似的機(jī)械性能與生物活性。培養(yǎng)7天后，將人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）接種在該皮膚模型上，建立雙層皮膚結(jié)構(gòu)（圖1 c） 。

 

圖 1.生物墨水設(shè)計(jì)和3D皮膚模型打印流程示意圖。（a） 使用甲基丙烯酸酯對(duì)果膠進(jìn)行化學(xué)改性，產(chǎn)生甲基丙烯酸果膠（PECMA），甲基丙烯酸酯用于光交聯(lián)，羧基用于與鈣結(jié)合

（b） 通過(guò)聚合物主鏈中的甲基丙烯酸酯和肽序列中的半胱氨酸（突出顯示為綠色）之間的硫醇-烯反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)水凝膠生物功能化（c） 第一步，由PECMA聚合物和定制的肽序列制備一種光交聯(lián)生物墨水，并通過(guò)添加氯化鈣進(jìn)行離子交聯(lián)來(lái)調(diào)節(jié)其流變性，然后混合和均質(zhì)化以獲得物理交聯(lián)的生物墨水；第二步，在生物墨水中加入真皮成纖維細(xì)胞并用Regemat 3D生物打印機(jī)打印成預(yù)設(shè)的真皮模型，并進(jìn)行體外培養(yǎng)7天；第三步，將HaCaT細(xì)胞接種到真皮模型上，體外培養(yǎng)7天；第四步，體外培養(yǎng)7天，待后續(xù)檢測(cè)

1. 用紫外光照射40秒（光交聯(lián)）后，添加了肽交聯(lián)劑的墨水具有814.0±129.1Pa的彈性模量；而未添加肽交聯(lián)劑的墨水沒(méi)有建立足夠密度的共價(jià)鍵，導(dǎo)致培養(yǎng)基中水凝膠結(jié)構(gòu)的完整性迅速喪失。然而，如果將光照時(shí)間延長(zhǎng)到60秒，即使沒(méi)有肽交聯(lián)劑，也可以形成穩(wěn)定的水凝膠結(jié)構(gòu)。該結(jié)果說(shuō)明，在肽交聯(lián)劑存在的情況下，二級(jí)水凝膠交聯(lián)主要通過(guò)階梯生長(zhǎng)機(jī)制進(jìn)行，反應(yīng)速率和形成水凝膠結(jié)構(gòu)的效率更快。

2. 在不同硬度的水凝膠中，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有顯著差異。在低硬度水凝膠中，細(xì)胞擴(kuò)散和細(xì)胞間接觸的能力明顯高于中等硬度和高硬度的水凝膠。說(shuō)明水凝膠的硬度，影響成纖維細(xì)胞在模擬真皮模型中生長(zhǎng)以及形成類似真皮結(jié)構(gòu)的過(guò)程。

3. 將HaCaT細(xì)胞接種在真皮模型并培養(yǎng)28天后，評(píng)估關(guān)鍵標(biāo)記物的位點(diǎn)特異性表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示：該皮膚模型呈現(xiàn)出預(yù)想的雙層結(jié)構(gòu)，上層為表皮（角質(zhì)形成細(xì)胞），下層為真皮（真皮成纖維細(xì)胞）。這種結(jié)構(gòu)與天然皮膚類似，未來(lái)可以考慮用于替代天然皮膚（圖2）。

圖2 生物打印 3D 皮膚模型（a） 具有圓形和方形形狀的雙層皮膚模型圖示，以及培養(yǎng)28天后它們的結(jié)構(gòu)完整性（比例尺頂部：2.5毫米;比例尺下：5毫米）。（b） 皮膚模型的免疫染色圖示（Epidermis表皮層：細(xì)胞角蛋白（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）;真皮層Dermis：波形蛋白（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）;比例尺：100μm））。

利用果膠、肽交聯(lián)劑、甲基丙烯酸酯和成纖維細(xì)胞，可以構(gòu)建出理想的真皮模型，其理化性能和細(xì)胞性能可以通過(guò)調(diào)節(jié)水凝膠的硬度、紫外光照時(shí)間等方式實(shí)現(xiàn)；在接種HaCaT細(xì)胞后，更可以構(gòu)建出理想的雙層皮膚細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這為未來(lái)人造皮膚的開(kāi)發(fā)提供了新的依據(jù)。

更多資訊請(qǐng)查閱原文：https://doi.org/10.3390/biomimetics9040228

 

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