光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤點(diǎn)：暗場(chǎng)

暗場(chǎng)觀察（Dark field）是和明場(chǎng)觀察（Bright field）對(duì)應(yīng)的一種觀察方式，其基本思路是屏蔽直射光，然后用散射光進(jìn)行觀察，實(shí)現(xiàn)類似丁達(dá)爾效應(yīng)的效果，揭示明場(chǎng)下無(wú)法觀察到的細(xì)節(jié)。星空可以說(shuō)一種暗場(chǎng)觀察，星星一直都在，但在白天有太陽(yáng)（直射光）的時(shí)候看不到，在晚上，不再有太陽(yáng)直射光，星星的散射光在黑暗的背景下變得可見(jiàn)。

ML31暗場(chǎng)拍攝的木槿花粉

一、成像原理

透射暗場(chǎng)光路

暗場(chǎng)成像原理簡(jiǎn)單，擋住直射光，只讓傾斜光照明樣品，樣品產(chǎn)生散射光，然后散射光通過(guò)物鏡成像。相比透射明場(chǎng)光路，透射暗場(chǎng)只是在光源到聚光鏡鏡片之間加入了暗場(chǎng)光闌，來(lái)?yè)踝」庠粗虚g的直射光，形成傾斜光照明樣品。

簡(jiǎn)易暗場(chǎng)聚光鏡產(chǎn)生倒置空心圓錐體照明

稍微復(fù)雜點(diǎn)說(shuō)，暗場(chǎng)聚光鏡會(huì)產(chǎn)生倒置空心圓錐體照明，并將焦點(diǎn)集中在樣品平面上，在沒(méi)有樣品且聚光鏡N.A大于物鏡N.A的地方，傾斜光會(huì)相互交叉并錯(cuò)開(kāi)物鏡，形成暗背景；而經(jīng)過(guò)樣品的傾斜光會(huì)產(chǎn)生衍射、反射/折射，形成明亮的樣品圖像。

反射（落射）暗場(chǎng)光路

反射暗場(chǎng)光路原理跟透射暗場(chǎng)光路一致，只是結(jié)構(gòu)有些變化，除了多了個(gè)環(huán)形反射鏡產(chǎn)生反射照明，其物鏡前端也有特殊的反射結(jié)構(gòu)來(lái)反射聚光，這種物鏡就是BD明暗場(chǎng)物鏡。

暗場(chǎng)是一種很好的觀察方式，特別適合呈現(xiàn)樣品輪廓、邊緣、邊界和折射率梯度，暗場(chǎng)成像的分辨率可以超出物鏡數(shù)值孔徑計(jì)算的分辨率，完美狀態(tài)下暗場(chǎng)甚至能呈現(xiàn)直徑20-40納米的鞭毛之類細(xì)節(jié)，但實(shí)際上比較難實(shí)現(xiàn)。

二、關(guān)鍵部件

暗場(chǎng)觀察有簡(jiǎn)易的，有專業(yè)。簡(jiǎn)易的透射暗場(chǎng)非常簡(jiǎn)單，加個(gè)暗場(chǎng)環(huán)（暗場(chǎng)光闌）即可。

專業(yè)的高倍暗場(chǎng)需要油浸式暗場(chǎng)聚光鏡、帶孔徑光闌的高倍物鏡；專業(yè)的金相暗場(chǎng)需要暗場(chǎng)反射模塊、明暗場(chǎng)物鏡。

·簡(jiǎn)易透射暗場(chǎng)（40X以下）

ML31簡(jiǎn)易暗場(chǎng)聚光鏡（阿貝聚光鏡+暗場(chǎng)環(huán)）

簡(jiǎn)易暗場(chǎng)觀察只需在阿貝聚光鏡基礎(chǔ)上加入暗場(chǎng)環(huán)即可實(shí)現(xiàn)，這個(gè)暗場(chǎng)環(huán)通常安裝于聚光鏡底部，用推拉插板或者32mm濾光片托架安裝都可以，一般簡(jiǎn)易暗場(chǎng)到N.A0.6效果都還行。也就是說(shuō)最高搭配Plan 40X或者Plan Fluo 20X物鏡，更高N.A的物鏡可能需要在聚光鏡和玻片底部之間滴油來(lái)提升照明N.A.

用3D打印實(shí)現(xiàn)的暗場(chǎng)環(huán)插板和暗場(chǎng)環(huán)

暗場(chǎng)環(huán)核心是遮擋直射光的圓形擋板，周邊鏤空通光。在簡(jiǎn)易暗場(chǎng)聚光鏡中，不同倍數(shù)物鏡匹配不同直徑的擋板，雖然高倍物鏡用大直徑擋板的暗場(chǎng)環(huán)也能觀察，但效果不佳，因?yàn)榘祱?chǎng)觀察中要求聚光鏡照明N.A高于物鏡N.A，而暗場(chǎng)環(huán)遮擋越大，照明N.A越低，可能出現(xiàn)照明N.A太低而效果很差。

·專業(yè)透射暗場(chǎng)（20X-100X）

專業(yè)暗場(chǎng)聚光鏡

專業(yè)的暗場(chǎng)聚光鏡有很多種，特點(diǎn)是特殊結(jié)構(gòu)，帶來(lái)特別高的N.A.以UIS系統(tǒng)的U-DCW油浸式暗場(chǎng)聚光鏡為例，其照明N.A可以到1.2-1.4，可以使用20X以上，N.A1.2以下的高倍物鏡。這種聚光鏡使用比較費(fèi)工夫，需要對(duì)中，并且滴油時(shí)不能有氣泡，否則暗場(chǎng)效果不佳。

暗場(chǎng)用的高倍物鏡

原則上，透射的暗場(chǎng)觀察無(wú)需特別的暗場(chǎng)物鏡，直接用普通物鏡即可。例外情況是100X物鏡，由于100X物鏡的N.A起碼都有1.25，而暗場(chǎng)照明要求照明N.A顯著大于物鏡N.A，因此連上述的U-DCW油浸式暗場(chǎng)聚光鏡都帶不動(dòng)一個(gè)普通Plan 100X. 為了滿足暗場(chǎng)使用，部分100X物鏡會(huì)加入可變光闌，用來(lái)降低物鏡N.A，以匹配暗場(chǎng)聚光鏡N.A.

·專業(yè)反射暗場(chǎng)（金相）

暗場(chǎng)反射模塊（從物鏡端看）

在金相顯微鏡中，明場(chǎng)和暗場(chǎng)觀察切換是通過(guò)切換反射模塊實(shí)現(xiàn)的，以金相顯微鏡MJ43為例，明場(chǎng)反射模塊主要是一片45°的半透半反鏡片，而暗場(chǎng)反射模塊則是在此基礎(chǔ)上整合了暗場(chǎng)光闌、45°環(huán)形反光鏡和一些減少雜散光的光闌，具體不同品牌的暗場(chǎng)反射模塊結(jié)構(gòu)會(huì)有不同。

金相顯微鏡的明暗場(chǎng)物鏡

反射暗場(chǎng)必須搭配金相明暗場(chǎng)物鏡。金相明暗場(chǎng)物鏡要比普通物鏡粗很多，因?yàn)樵诮鹣喾瓷浒祱?chǎng)中，暗場(chǎng)照明光線并不通過(guò)物鏡聚焦到樣品上，物鏡主體以外要留出一圈空間給暗場(chǎng)照明的光通過(guò)，另外物鏡前端可以看到外殼是明顯向前端延申的，以讓暗場(chǎng)照明光傾斜反射到樣品上，在到達(dá)前端反射前，會(huì)有一圈環(huán)形的透鏡或棱鏡對(duì)光線進(jìn)行調(diào)整。

三、成像特點(diǎn)

ML31暗場(chǎng)下的跳蚤：暗背景，豐富細(xì)節(jié)

透射暗場(chǎng)成像主要有三個(gè)特點(diǎn)：

1、暗背景亮樣品。暗場(chǎng)成像最明顯特點(diǎn)是暗背景、亮樣品，背景暗的程度與照明N.A和物鏡N.A的搭配情況相關(guān)，通常低于熒光成像或正交偏光成像。樣品會(huì)明顯比背景亮，且呈現(xiàn)完整、細(xì)節(jié)豐富。

2、顏色真實(shí)艷麗。暗場(chǎng)成像能真實(shí)反映樣品的色彩，同時(shí)因?yàn)楸尘鞍禈悠妨�，�?huì)形成很好的對(duì)比度，讓樣品顏色比明場(chǎng)更真實(shí)艷麗。

3、瑕疵可見(jiàn)。暗場(chǎng)成像不僅能突出樣品細(xì)節(jié)，還能突出玻片灰塵、光路灰塵等瑕疵，在離焦面上形成大小不一的光斑，有時(shí)可能影響細(xì)節(jié)呈現(xiàn)，因此清潔光路和樣品對(duì)保障暗場(chǎng)成像質(zhì)量很重要。

MJ33下PCB明暗場(chǎng)對(duì)比成像

反射暗場(chǎng)成像特點(diǎn)與透射不太一樣，主要特點(diǎn)是：

1、暗平面亮凹凸。樣品平面部分的光線不會(huì)到達(dá)物鏡，因此會(huì)呈現(xiàn)為暗背景，而凹凸不平的地方則會(huì)形成散射，到達(dá)物鏡，比如氣孔、凸起、劃痕、灰塵等都會(huì)呈現(xiàn)出來(lái)。

四、主要應(yīng)用

1、生物學(xué)領(lǐng)域

暗場(chǎng)觀察和熒光觀察檢查螺旋體①

用暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè)梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等螺旋體是推薦的方法，因?yàn)閮x器成本比相襯顯微鏡低，且在比較低倍觀察下就可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)染色的螺旋體的存在。

暗場(chǎng)（C）觀察單衣藻和口腔上皮細(xì)胞（D）②

暗場(chǎng)顯微鏡還可以用來(lái)觀察微生物運(yùn)動(dòng)和細(xì)節(jié)，比如在明場(chǎng)下單衣藻很難看出鞭毛等一些細(xì)節(jié)，而使用暗場(chǎng)觀察可以清晰看到鞭毛以及部分內(nèi)部細(xì)節(jié)。使用暗場(chǎng)觀察口腔上皮細(xì)胞，也可以看到細(xì)胞核等細(xì)節(jié)。

暗場(chǎng)下的硅藻

暗場(chǎng)顯微鏡還適合用于觀察一些微小生物，如水生生物、硅藻、小昆蟲(chóng)、未染色的細(xì)菌、酵母、組織培養(yǎng)細(xì)胞和原生動(dòng)物，此外骨、纖維、頭發(fā)也是暗場(chǎng)觀察的理想目標(biāo)。

2、金相領(lǐng)域（材料學(xué)、工業(yè)等）

MJ43明暗場(chǎng)對(duì)比檢查芯片焊點(diǎn)

在金相領(lǐng)域，暗場(chǎng)觀察通常搭配明場(chǎng)觀察使用，來(lái)呈現(xiàn)明場(chǎng)觀察下無(wú)法發(fā)現(xiàn)的氣孔、凸起、劃痕、灰塵等瑕疵，比如檢查芯片焊點(diǎn)等芯片檢查工作。

MJ33暗場(chǎng)拍攝測(cè)量薄膜厚度

在一些孔隙率差異或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片，比如薄膜、光纖中，使用明場(chǎng)觀察會(huì)有邊緣模糊的問(wèn)題，導(dǎo)致尺寸測(cè)量存在不準(zhǔn)確的問(wèn)題，使用暗場(chǎng)觀察可以更準(zhǔn)確呈現(xiàn)邊緣，使尺寸測(cè)量更加準(zhǔn)確。

五、明美產(chǎn)品推薦

1、生命科學(xué)推薦產(chǎn)品：生物顯微鏡ML31暗場(chǎng)配置

 

• 簡(jiǎn)易透射暗場(chǎng)觀察，可快速切換明場(chǎng)暗場(chǎng)

• 10X/22大視野目鏡，更高工作效率

• 滿足40X-400X暗場(chǎng)觀察需要

• 適用于疾控螺旋體觀察、藻類等微小生物觀察

2、芯片質(zhì)檢和金相分析推薦產(chǎn)品：研究級(jí)金相顯微鏡MJ43-BD

 

• 研究級(jí)機(jī)身，支持明場(chǎng)、暗場(chǎng)、偏光觀察方式

• 可選半復(fù)消色差或復(fù)消色差BD明暗場(chǎng)物鏡

• 可擴(kuò)展熒光觀察等其他觀察方式

• 適用于材料芯片、硅片、金相樣品等觀察和質(zhì)檢

3、金相分析推薦產(chǎn)品：倒置金相顯微鏡MJ42BD

• 倒置金相顯微鏡，工作空間更大

• 長(zhǎng)工作距離平場(chǎng)消色差BD明暗場(chǎng)物鏡

• 支持明場(chǎng)、暗場(chǎng)、偏光觀察方式

• 適用于金相組織、礦物樣品的觀察
   

4、大樣品檢查和測(cè)量推薦產(chǎn)品：金相顯微鏡MJ31BD大臺(tái)面

• 超大載物臺(tái)，適合PCB等大尺寸樣品

• 可選消色差或半復(fù)消色差BD明暗場(chǎng)物鏡

• 支持明場(chǎng)、暗場(chǎng)、偏光觀察方式

• 適用于大片PCB等大尺寸樣品的觀察

①M(fèi)ETHODS article,Front. Cell. Infect. Microbiol., 20 August 2019,Sec. Molecular Bacterial Pathogenesis,Volume 9 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00287

②Charlotte K. Omoto，華盛頓州立大學(xué)，使用CH2教學(xué)顯微鏡拍攝

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