我們比較了在二維聚苯乙烯培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的人類肺癌細胞與使用BIO X進行3D生物打印的肺癌細胞。在3D細胞培養(yǎng)中，細胞重新排列成球狀體，且連接蛋白的分布在二維培養(yǎng)中無法檢測到。

01 文章
Title:“In Vitro 3D Lung Cancer Model Presents a More Relevant Expression of Junctional Proteins than 2D Cultures”
作者：Josefin Blell, MSc, Shubhankar Nath, PhD,Christen Boyer, PhD, and Itedale Namro Redwan, PhD CELLINK, Gothenburg, Sweden
摘要：肺癌是世界上癌癥相關死亡的主要原因之一。為了能夠研究這種復雜的疾病和驅(qū)動轉(zhuǎn)移的機制，需要開發(fā)更多與生理相關的體外模型。本研究將人肺癌細胞分別在二維聚苯乙烯板和3D生物打印的甲基丙烯酸明膠(GelMA)和Matrigel中培養(yǎng)14天，觀察球形形成、細胞形態(tài)和連接蛋白。定性分析顯示，與在二維條件下生長的細胞相比，在三維生物打印模型中，β-連環(huán)蛋白和緊密連接蛋白-1的表達模式更具生理相關性。3D生物打印模型中顯示的細胞重排成球體和連接蛋白的分布在2D培養(yǎng)中無法檢測到，突出了3D微環(huán)境的重要性。這些結(jié)果表明，3D生物打印有助于建立更相關的體外疾病模型，并可能使研究人員受益于癌癥研究、分子生理學和藥物開發(fā)中的自動化分析工具。肺的重要功能是向身體交換氣體�？諝鈴臍夤苓M入稱為肺泡的最小氣囊，肺泡形成呼吸表面，允許氣體擴散(Zscheppang, 2018)。

02 前言
由于進入的空氣中含有免疫系統(tǒng)需要對抗的病毒、污染物和過敏原，免疫系統(tǒng)承受著很大的壓力。肺癌是世界上最常見的癌癥死亡原因(Zscheppang, 2018)。這是一種復雜的疾病，需要更多的生理相關模型來理解細胞異常行為背后的機制。傳統(tǒng)上，體外癌癥模型是基于二維單層培養(yǎng)的，這有助于研究人員對癌變機制有更深入的了解。然而，研究人員開始意識到使用平面模型研究發(fā)生在生物體中的復雜疾病的局限性。哺乳動物細胞嵌入細胞外基質(zhì)(ECM)中生長，細胞外基質(zhì)賦予組織機械特性，促進細胞間通訊(Baker, 2012)。因此，必須開發(fā)仿生肺腫瘤模型，以便更好、更快地測試潛在的候選藥物。此外，轉(zhuǎn)移和癌癥進展的研究對于更好地了解這種疾病以及如何對抗它至關重要。癌細胞經(jīng)常在三維微環(huán)境中自組裝成多細胞腫瘤球體。這些成熟的結(jié)構允許細胞和周圍環(huán)境之間的相互作用。在本研究中，研究了生物打印3D構建物中肺癌細胞球形結(jié)構的形成，并使用相關分子標記，如β-catenin、CD44和(ZO-1)，與2D培養(yǎng)物進行了比較(圖1)。

2.1 E-cadherin/β-catenin復合物
E-cadherin/β-catenin復合物在細胞-細胞粘附中起關鍵作用，特別是在上皮細胞中。具體來說：

2.1.1 E-cadherin/β-catenin復合物的功能
E-cadherin：是一種粘附分子，主要在細胞膜上表達，負責細胞之間的粘附。
β-catenin：與E-cadherin結(jié)合，幫助連接細胞骨架，從而維持細胞間的穩(wěn)定聯(lián)系。

2.1.2 復合物變化對癌癥的影響
當E-cadherin/β-catenin復合物的結(jié)構或表達發(fā)生變化時，細胞間的粘附會被抑制。

這種變化可能導致細胞之間的粘附力減弱，細胞更容易脫離原有組織，成為游離狀態(tài)。

這種游離的細胞可能會獲得侵襲性特征，能夠侵入鄰近組織，甚至通過血液或淋巴系統(tǒng)擴散到遠處部位，形成轉(zhuǎn)移性癌癥。

2.1.3 與癌癥的關系
E-cadherin的表達下降或β-catenin定位異常（例如從細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞核）常與癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移性增加有關。

這些變化通常標志著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的啟動，這是一個在癌癥發(fā)展中常見的現(xiàn)象，涉及細胞從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型，增強其遷移和侵襲能力。

2.2 CD44
CD44是一種跨膜糖蛋白，在正常和癌組織的細胞表面廣泛表達。參與細胞間相互作用、細胞粘附和遷移。高水平的CD44表達與癌癥進展有關。

2.3 ZO-1 (Zonula Occludens-1)
ZO-1是一種支架蛋白，決定上皮細胞形成緊密連接鏈。緊密連接確保質(zhì)膜頂端和基底外側(cè)區(qū)域之間的分離，并作為擴散屏障，介導細胞遷移。ZO-1的表達維持氣道和肺泡上皮血管之間的屏障，表明緊密連接的存在。

ZO-1表達異常，緊密連接功能障礙會破壞上皮屏障，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和腫瘤轉(zhuǎn)移。

在這項研究中，研究了在3D生物打印的甲基丙烯酸明膠(GelMA)或基質(zhì)凝膠液滴中肺癌細胞從單細胞重排到球體以及緊密連接的表達，并與傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)進行了比較。
 

圖1所示：生物打印和連接蛋白信號通路的說明

03  材料和方法
☆☆細胞培養(yǎng)

• 人肺癌A549細胞系在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

• A549細胞以800萬個細胞/mL的濃度與GelMA或Matrigel Matrix混合，并通過22G噴嘴以10µL的液滴形式分配。

☆☆3D生物打印和培養(yǎng)

• GelMA生物墨水用BIO X™ 3D生物打印機打印并使用405 nm光模塊進行光交聯(lián)。

• Matrigel手動分配到96孔板中并在37℃下進行30分鐘的熱交聯(lián)。

• 樣品在37°C和5% CO2下培養(yǎng)，每周三次更換培養(yǎng)基，分別在3D或2D環(huán)境中培養(yǎng)14天或4天。

☆☆細胞固定與染色

• 3D構建體固定、脫水、浸潤、石蠟包埋及切片處理（具體方法見附件1）。

• 2D細胞固定、滲透及阻斷處理。

• 使用特定抗體（β-catenin、CD44、ZO-1）進行免疫組織化學染色和共聚焦成像。
   

圖2：第4天A549的2D亮場圖像，第14天嵌入GelMA和Matrigel。比例尺= 100µm

生物墨水內(nèi)細胞的形態(tài)及其重新排列環(huán)境的能力至關重要。A549細胞在適當?shù)奈�環(huán)境中能夠自然自組裝成球體。從亮場圖像（圖2）可以明顯看出，A549細胞在2D環(huán)境中以單細胞的形式生長，具有平坦的形態(tài)，而在生物打印過程中，當A549細胞作為分散的單細胞嵌入GelMA和Matrigel中時，14天后，細胞在生物墨水中自然聚集并形成球體。球體的大小和形狀的差異可能表明更類似于體內(nèi)的模式，但可能是不同腫瘤模型中數(shù)據(jù)差異的來源。

對A549細胞進行β-catenin染色分析顯示，在整個網(wǎng)絡中存在不同的表達模式（圖3）。在不同細胞區(qū)室的定位與其在質(zhì)膜上的功能有關，在質(zhì)膜上它與細胞粘附蛋白（如E-cadherin）相互作用并調(diào)節(jié)細胞間相互作用。結(jié)果表明，在二維培養(yǎng)模型中存在細胞核和細胞質(zhì)定位，而在三維培養(yǎng)模型中表達定位于細胞-細胞連接。先前的研究顯示了3D培養(yǎng)中A549細胞的自然環(huán)境的相關再現(xiàn)，其中β-catenin表達定位于細胞-細胞連接處，表明極化和粘糖蛋白的產(chǎn)生，而2D培養(yǎng)則沒有（Carterson, 2015）。
 

圖3：A549 β-catenin在2D單層細胞中的表達于第4天，在GelMA和Matrigel的3D培養(yǎng)中于第14天。為了更好地可視化定位，對每個條件下的圖像處理進行了優(yōu)化。比例尺= 100µm
 

圖5：ZO-1在A549中的表達(紅色)和DAPI(藍色)。所有的照片都是用相同的曝光時間拍攝的。比例尺= 100µm

與2D細胞培養(yǎng)相比，3D生物打印具有多種優(yōu)勢，包括多細胞結(jié)構的精確幾何排列，可以更好地再現(xiàn)天然的3D人體生理。細胞根據(jù)來自周圍細胞和環(huán)境的外部信號進行自我組裝。這一重要現(xiàn)象有助于理解腫瘤的形成，并有潛力促進藥物開發(fā)和篩選。

04 結(jié)果與討論
4.1 細胞形態(tài)和球體形成

• A549細胞在2D環(huán)境中以單細胞形式生長，形態(tài)扁平。

• 在3D生物打印過程中，A549細胞在GelMA和Matrigel中聚集并形成球體，模擬體內(nèi)環(huán)境。

4.2 腫瘤標志物表達

• β-catenin染色顯示在3D培養(yǎng)模型中表達定位于細胞-細胞連接處，而在2D培養(yǎng)模型中存在細胞核和細胞質(zhì)定位。

• 3D培養(yǎng)模型中的A549細胞表現(xiàn)出更具生理相關性的β-catenin表達模式。

4.3 細胞重排和微環(huán)境重塑

• 在GelMA和Matrigel中，A549細胞在14天內(nèi)聚集成球體，而在二維樣品中未見此現(xiàn)象。

• 球體結(jié)構是藥物開發(fā)和理解細胞過程的重要工具，能夠增加細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用，模擬體內(nèi)癌癥模型。

05 參考文獻
見網(wǎng)址：
https://go.pardot.com/l/894101/2020-11-23/qxj/894101/1606150763BkyhQhDN/In_Vitro_Lung_Cancer_Model_Application_Note_112020v5.pdf