IC-MS在代謝組學(xué)中的應(yīng)用：精確分析生物樣本中的小分子代謝物
時至今日，代謝組學(xué)已經(jīng)成為生物組學(xué)研究領(lǐng)域的重要組成部分。通過檢測生物樣本中小分子代謝物，使得我們對于各種生物體的代謝系統(tǒng)以及代謝組與基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組在生命的分子過程中的相互作用有了深入的理解。
高分辨質(zhì)譜（HRMS）技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和統(tǒng)計分析是當(dāng)前表征生物樣本中小分子代謝物的主要手段之一。然而，由于生物體內(nèi)代謝物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣，實現(xiàn)生物樣本中小分子代謝物的全覆蓋鑒定和準(zhǔn)確定量分析仍然是本領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。其中，大極性、離子代謝物的檢測尤其受到關(guān)注。離子色譜主要使用離子交換的分離原理，和常規(guī)液相色譜主要基于疏水吸附的反相分離原理形成互補，可以很好分離常規(guī)液相色譜難以分離的強極性可電離代謝物。即使是基于親水相互作用的HILIC色譜可以分離強極性代謝物，但也難以分離強電離代謝物。離子型物質(zhì)分離，必須使用離子型物質(zhì)做為流動相，但離子型物質(zhì)本身與質(zhì)譜的最佳檢測環(huán)境并不兼容。因此，我們需要安裝膜抑制器作為一個持續(xù)工作的脫鹽裝置，通過膜轉(zhuǎn)移的原理去除對位離子，使酸堿變成純水，從而實現(xiàn)與質(zhì)譜兼容。
圖1 不同極性化合物需要不同的色譜分離系統(tǒng)進行分析
分離度
核苷酸、糖類等在代謝通路中存在多個同分異構(gòu)體，這些同分異構(gòu)體在細(xì)胞代謝中承擔(dān)著不同且重要的功能。因此，我們不僅需要檢出相關(guān)化合物，更需要將這些同分異構(gòu)體代謝物進行有效色譜分離。圖2展示了IC與HILIC分析21種極性代謝物對照品的分離效果。大部分化合物在HILIC色譜柱上出峰情況良好，然而，對于磷酸糖類以及順式、反式丁烯二酸等同分異構(gòu)體代謝物來說，HILIC的分離效果明顯差于IC。在細(xì)胞樣本的測試中，不同色譜條件下對m/z 259.0224進行提取離子流（圖3）。IC色譜條件下檢測到了11個色譜峰，檢出數(shù)量和強度顯著高于其他色譜條件。根據(jù)精確質(zhì)荷比信息，推測該系列化合物的元素組成為C6H13O9P，在代謝物數(shù)據(jù)庫中檢索，有至少33個代謝物符合該元素組成，其中包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等多種重要的磷酸單糖。
圖2 21種代謝物對照品使用IC和HILIC進行分離的峰形比較
圖 3 細(xì)胞樣本中磷酸單糖化合物在不同色譜條件下的色譜分離比較
靈敏度
在濃度為60 ppb（0.2-0.7 μmol/L）的情況下，使用IC-MS分析極性代謝物對照品。（圖2）這些代謝物的信噪比（S/N）約為1000，相當(dāng)于柱上量0.5-2.5 pmol。其中一半的代謝物可在非常低的濃度下（60 ppt，相當(dāng)于柱上樣量3.4 fmol以下）被檢測到，信噪比在3到20之間。最低檢測限（LODs）的濃度范圍為0.04-0.5 nmol/L（見表1），展示了超高靈敏度。
表1 21種代謝物在cap IC-Orbitrap平臺的最低檢測限（LODs）
重現(xiàn)性
在連續(xù)6天的日間穩(wěn)定性考察中，每天平行測試6針對照品混標(biāo)（600 ppb），所有化合物的保留時間和響應(yīng)強度RSD均小于8%，完全適應(yīng)代謝組學(xué)分析要求。（圖4）在實際細(xì)胞樣本測試中，6種細(xì)胞中的11種磷酸單糖以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)馬尿酸-d5的色譜保留時間和響應(yīng)強度同樣表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性（n=3）。
圖4 日間重現(xiàn)性考察（n=6）
圖5 不同細(xì)胞樣本中11種磷酸單糖的離子流圖
代謝通路覆蓋度
采用IC-MS的方法進行細(xì)胞代謝組學(xué)分析，幾乎完整地覆蓋了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要代謝物。（圖6）通過相關(guān)測試結(jié)果，可以幫助我們有效觀察細(xì)胞能量代謝、代謝穩(wěn)態(tài)的變化。
圖6 糖酵解、TCA代謝途徑及細(xì)胞樣本中相關(guān)代謝物含量測試結(jié)果
小結(jié)
離子抑制技術(shù)的發(fā)展，特別是連續(xù)電解離子抑制技術(shù)，使得離子交換色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合成為可能，這種組合帶來了新的分析機會。IC-MS平臺技術(shù)的商業(yè)化推廣使得越來越多的實驗室探索了IC-MS的新應(yīng)用領(lǐng)域，并揭示了超出傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域的成功案例。例如，除了對無機離子的分析外，有機和生物極性和離子分析物已經(jīng)成功地在廣泛的環(huán)境和生物樣品類型中進行了有針對性的分析和表征。使用離子抑制的IC-MS分析具有產(chǎn)生洗脫劑和極性選擇性的組合特性，減少了有效基質(zhì)復(fù)雜性，降低了質(zhì)譜檢測中可能導(dǎo)致分析干擾的基質(zhì)效應(yīng)和色譜擁擠。分析物通常已經(jīng)處于離子形式；因此，通過質(zhì)譜檢測實現(xiàn)高靈敏度分析可以最大程度地減少離子抑制。相比之下，用于離子和高極性分析物表征的其他色譜方法（如RP-MS、HILIC-MS、GC-MS和IP-MS）可能抑制分析物的離子特性（使用低質(zhì)子溶劑、衍生化等），以便提供有效的分析條件，這可能導(dǎo)致覆蓋范圍和信號抑制的偏差�？傊琁C-MS已經(jīng)成為一種有效的互補（或替代）分析工具，表現(xiàn)出高水平的平臺穩(wěn)定性、保留時間重現(xiàn)性、靈敏度和低檢測限。迄今為止，大多數(shù)應(yīng)用集中在法醫(yī)科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、技術(shù)和制造業(yè)以及食品化學(xué)領(lǐng)域。然而，在制藥科學(xué)、臨床化學(xué)、診斷學(xué)、微生物學(xué)、代謝組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，這些領(lǐng)域還有許多重要的進一步發(fā)展和應(yīng)用的空間（圖5）。無論是在復(fù)雜基質(zhì)中還是在高極性或離子分析物中，IC-MS都有新的應(yīng)用空間。展望未來，我們認(rèn)為IC-MS的未來應(yīng)用將包括對復(fù)雜生物和環(huán)境系統(tǒng)和過程的深入研究，宿主-病原體關(guān)系，微生物組代謝，植物與土壤化學(xué)之間的關(guān)系，藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)，以及與疾病的診斷、預(yù)后和病因相關(guān)的生物標(biāo)志物研究。從傳統(tǒng)意義上講，這些領(lǐng)域在分析上具有特殊的挑戰(zhàn)性，特別是在使用非靶向方法時；因此，IC-MS在發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向和有針對性應(yīng)用中有潛力發(fā)揮重要作用。
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