一、介紹
鱟試劑（LAL）測定法是藥典中用于檢查藥品（如USP <85>章所述）、加工材料和藥用級水中細菌內(nèi)毒素的檢測方法。

對于任何生物測試，測試結(jié)果都容易受到分析條件變化的影響。在這里，鱟試劑測定法即使作為生物測定法，也具有相對較高的變異性^[1]。這種變化主要來自3個方面：試劑、產(chǎn)品和方法^[2]。本文以光度法（顯色法和比濁法）為重點，探討了造成鱟試劑檢測差異的一些原因，并研究了如何通過良好的實驗室質(zhì)量控制來評估差異。

二、鱟試劑測試的變異性
鱟試劑檢測的不同方面都會造成差異。這些方面包括鱟試劑、內(nèi)毒素對照標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋誤差。我們將依次對這些方面進行研究。

（一）鱟試劑
鱟試劑會導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異，原因如下：
鱟試劑（鱟溶解物）來源于生物，是多種酶和輔助因子的復(fù)雜混合物。該提取物是相對粗糙的混合物，不是單一的純化酶，這意味著無法準(zhǔn)確測定每批裂解物的酶活性。

生產(chǎn)過程中會添加緩沖劑和洗滌劑，這也是造成差異的一個原因。

制造商使用美國藥典提供的參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（RSE）對每批鱟試劑的酶活性進行評估，通過進行2倍稀釋系列來評估鱟試劑的靈敏度。用于表征裂解液的RSE因其稀有性和昂貴性，并非所有檢測實驗室都能輕易獲得，所以實驗室通常使用細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效力由鱟試劑供應(yīng)商根據(jù)RSE評估CSE來確定。這就增加了測試差異的可能性。

（二）細菌內(nèi)毒素
檢測中使用的內(nèi)毒素會導(dǎo)致差異，這是因為：
實驗室中用于制備細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）的內(nèi)毒素來自純化的大腸桿菌菌株。CSE是一種高度純化的脂多糖，不含大多數(shù)可檢測的污染物（如蛋白質(zhì)）。CSE含有額外的穩(wěn)定填充劑，如淀粉、人血清白蛋白和聚乙二醇。然而，環(huán)境內(nèi)毒素未經(jīng)純化，通常以脂多糖、細胞膜蛋白和磷脂的大分子復(fù)合物的形式存在，這些物質(zhì)由革蘭氏陰性細菌在生長和死亡過程中脫落。因此，根據(jù)純化內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)測定環(huán)境內(nèi)毒素時存在差異^[3]。

此外，盡管鱟試劑檢測對內(nèi)毒素具有特異性，但它只能檢測內(nèi)毒素分子中可用于激活裂解物的脂質(zhì)A部分（凝血級聯(lián)反應(yīng)的激活，因子C通路，如下所述）^[4]。內(nèi)毒素分子的脂質(zhì)A部分可能形成未完全分散的聚集體，因此不夠均勻，無法進行準(zhǔn)確的總測量。

因此，檢測到內(nèi)毒素的樣品不一定能顯示出樣品中的所有內(nèi)毒素，因為這取決于脂質(zhì)A的含量，所以檢測到內(nèi)毒素的樣品可能會被低估。此外，檢測到內(nèi)毒素的樣本在重復(fù)檢測時可能不會顯示出相同水平的內(nèi)毒素，因為隨著時間的推移，樣本的化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性會發(fā)生變化，脂質(zhì)A的可用性也會隨之改變。還應(yīng)注意的是，不同類型的環(huán)境內(nèi)毒素的毒性和反應(yīng)性有所不同，這取決于脂質(zhì)A分子對不同細菌種類的生物活性。

（三）鱟試劑檢測法的變異性
鱟試劑檢測法固有的變異性為50%至200%（或每個內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)兩側(cè)各有一個2倍誤差）。對于動力學(xué)測定法，變異性源于內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率^[5]。

檢測變化可能來自一系列測試輸入，包括：
●試管
●一次性移液器吸頭
●微量移液器吸頭

針對上述情況，BET測試中使用的塑料（例如微量滴定板、塑料稀釋管）通常不是專門為內(nèi)毒素檢測而制造的。
●無菌技術(shù)
●分析技術(shù)
●移液方法的差異
●制備控制標(biāo)準(zhǔn)品的差異
●稀釋液配制過程中的變化（如果錯誤發(fā)生在系列中的第一個稀釋中，則差異會放大）

長期儲存的稀釋液會發(fā)生變化�？勺円蛩匕�括溫度、容器成分、稀釋范圍和稀釋體積）。
●交叉污染
●產(chǎn)品或樣品干擾
●取樣容器
●樣品儲存時間和溫度
●LAL儀器/模塊變化——不同的儀器可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果
●產(chǎn)品中存在內(nèi)毒素（內(nèi)毒素分子表現(xiàn)不同或脂質(zhì)A的可用性不同）
●添加緩沖液以穩(wěn)定pH值

輔助溶液可能不含內(nèi)毒素。

上述某些問題與檢測技術(shù)人員的操作直接相關(guān)（如稀釋液的配制、移液、原材料的稱重和無菌技術(shù)等）。

（四）內(nèi)毒素濃度
隨著標(biāo)準(zhǔn)系列使用的內(nèi)毒素濃度變小，誤差的顯著性也會增加。例如，標(biāo)準(zhǔn)曲線為1.0至0.1 EU/mL時，50%至200%的誤差將比5.0至0.005 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列產(chǎn)生的影響較小，這是因為標(biāo)準(zhǔn)系列中最后一個內(nèi)毒素濃度值較小。也許正是由于這些原因，藥典中列出的測試對照品的可接受加標(biāo)回收率為50%至200%。

（五）稀釋誤差
測試稀釋時可能會出現(xiàn)錯誤，特別是在稀釋內(nèi)毒素和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時。為避免在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時出現(xiàn)稀釋誤差，建議采取以下控制措施：

每批內(nèi)毒素或裂解物在常規(guī)使用前，應(yīng)由3名技術(shù)人員對稀釋系列進行鑒定，每次對稀釋系列進行3次驗證。每個接受過該試驗培訓(xùn)的新技術(shù)人員都要進行類似的操作。

對于常規(guī)檢測，不同試驗的稀釋順序不應(yīng)有差異（即，始終進行相同類型的稀釋）。

內(nèi)毒素的起始濃度應(yīng)始終保持相同（通常為1000EU/mL）。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)相同的內(nèi)毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的。這一點可通過查看生產(chǎn)商的分析證書進行驗證，也可通過比較使用中的對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（均為大腸桿菌O113:H10的純化提取物）對生產(chǎn)商的證書進行確認(rèn)測試。

盡管如此，在上述情況下，如果進行測試的技術(shù)人員出了差錯，仍有可能發(fā)生稀釋錯誤。

（六）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系
標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是鱟試劑檢測的一個重要特征。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的y軸截距僅發(fā)生1%的變化，就會導(dǎo)致內(nèi)毒素測定值發(fā)生30%至35%的變化。因此，已知10EU/mL的樣品可能讀數(shù)為13.5EU/mL，這并不是因為樣品中的內(nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因為y-截距發(fā)生了變化�？刂茲岫确�鱟試劑檢測變異性的一個重要方法是密切關(guān)注起始（反應(yīng)）時間。這些起始時間看似微小的變化都會導(dǎo)致線性、斜率和y軸截距的變化，從而對檢測結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[6]。

三、評估差異
雖然可以采取措施減少變異，但根據(jù)良好質(zhì)量控制的原則，實驗室應(yīng)該有監(jiān)督和評估的手段，以確定檢測結(jié)果是否令人滿意，以及變異是否過大到足以引起關(guān)注的程度。其中一種方法就是審查變異系數(shù)（CV）。

（一）變異系數(shù)的應(yīng)用
變異系數(shù)是精確度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。分析程序的精確度是指單個檢測結(jié)果之間的一致程度（或者，用檢測術(shù)語來說，是指當(dāng)分析程序重復(fù)應(yīng)用于單一、同體積生物基質(zhì)的多個等分試樣時，單個分析物測量結(jié)果的接近程度）^[7]。變異系數(shù)是以平均值的百分比表示的標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)不同樣本之間的平均值增加時，變異系數(shù)值就可以用來測量變異性。

通常，變異系數(shù)表示為測試重復(fù)之間的百分比（%CV）。這可以應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線點和測試樣品復(fù)制。對于鱟試劑，常見的要求是CV≤10%或≤25%（取決于裂解物供應(yīng)商設(shè)定的要求）。百分比變異系數(shù)越低，說明不同測試副本之間的精確度越接近（與平均值的“散差”相對較�。�。

計算CV有不同的方法。這些方法與計算標(biāo)準(zhǔn)差的不同方法有關(guān)。一旦采用了標(biāo)準(zhǔn)差的計算方法，CV就可以表示為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之間的比率。

由此，可以計算出%CV值：
100% ×（標(biāo)準(zhǔn)差/算術(shù)平均數(shù)）

從上式可以看出，CV轉(zhuǎn)換為百分比的方法是將得到的數(shù)字乘以100，得出%CV值^[8]。

在評估鱟試劑檢測時，根據(jù)EU/mL的測量值計算出的%CV值通常會隨著內(nèi)毒素濃度的降低而增加，因為較高濃度的內(nèi)毒素通�？色@得<10%的值，而較低濃度的內(nèi)毒素（通常接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的末端并接近檢測限）可獲得10%到30%的值。

在此需要指出的是，不同的鱟試劑供應(yīng)商對鱟試劑檢測有不同的驗收標(biāo)準(zhǔn)，并通過軟件包以不同的方式計算其%CV值。例如，有些供應(yīng)商根據(jù)以每毫升內(nèi)毒素單位（EU/ mL）表示的結(jié)果來計算變異系數(shù)；而有些供應(yīng)商則根據(jù)樣品的起始時間（以毫吸光為單位）來計算變異系數(shù)^[9,10]。

（二）檢測稀釋錯誤
除變異系數(shù)外，稀釋誤差也需要評估。為了檢查鱟試劑檢測是否正確，應(yīng)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線上內(nèi)毒素濃度最高點的反應(yīng)時間，確保其在以秒為單位的預(yù)期時間范圍內(nèi)。這一點非常重要，因為這些起始時間看似微小的變化會導(dǎo)致線性度、斜率和Y-截距的變化，從而對測試結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[11]。

為此，需要檢查起始內(nèi)毒素濃度的起始時間（如5.0 EU/ml）。這需要對歷史數(shù)據(jù)進行研究，以確定典型范圍。為了提高準(zhǔn)確性，建議對使用內(nèi)毒素進行的前100次測試進行評估。如果稀釋液的制備出現(xiàn)錯誤，那么起始時間將超出預(yù)期范圍。

檢測起始時間是檢測誤差的一個重要指標(biāo)，因為它直接關(guān)系到光度法LAL檢測方法的工作方式。采用動態(tài)濁度法或顯色法進行LAL檢測時，裂解液（等分到反應(yīng)管中）會與等分樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液中的任何內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)^[12]。所發(fā)生的反應(yīng)是根據(jù)時間測量濁度或顏色的變化。達到濁度閾值（在預(yù)先設(shè)定的光學(xué)范圍內(nèi)以毫吸光度單位測量）的時間越快，內(nèi)毒素濃度就越高。這一起始時間范圍不僅因內(nèi)毒素水平而異，而且不同批次的裂解液和對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素也會有所不同。

起始時間必須在正確的范圍內(nèi)，因為它可以確定已進行了正確的稀釋。舉例來說，如果測試的稀釋方法不正確，相關(guān)系數(shù)和報告的內(nèi)毒素值看起來仍然是正確的。這是因為相關(guān)系數(shù)是實際值與預(yù)期值之間的最佳擬合線，而軟件會解釋這些數(shù)據(jù)，并通過從標(biāo)準(zhǔn)系列中推斷出估計的內(nèi)毒素濃度^[13]。

根據(jù)平均值的第二個標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以計算出起始濃度的光密度達到所需閾值所需的時間范圍。 鑒于LAL檢驗本身存在誤差（通常認(rèn)為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗方法保持一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化，第二個標(biāo)準(zhǔn)差可以說是最合適的測量方法。標(biāo)準(zhǔn)差是衡量單個元素偏離平均值（均值）的程度。其計算公式為方差的平方根（如圖1所示）。
 

使用平均值的2個標(biāo)準(zhǔn)差表明95%的值落在上下限范圍內(nèi)。除此之外的5%代表非典型值。

每次LAL檢驗完成后，記錄最高內(nèi)毒素濃度（曲線起點）的起始時間都要與這一范圍進行比較，只有當(dāng)測得的起始時間在這一范圍內(nèi)時，才可認(rèn)為檢驗是合格的。如果出現(xiàn)稀釋錯誤，那么起始時間就會超出預(yù)期的時間范圍。

通過采用平均值的2個標(biāo)準(zhǔn)差，任何超出計算范圍的測試值都被視為非典型值，不能代表正常人群。因此，需要對LAL測試進行調(diào)查。作為進一步檢查技術(shù)員工作表現(xiàn)的一種方法，區(qū)域主管可對每位技術(shù)員標(biāo)準(zhǔn)曲線的起始時間進行趨勢分析和檢查。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)
還可以對標(biāo)準(zhǔn)系列的線性度進行額外的檢查。為此，應(yīng)檢查每次測試的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（要求相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980）。藥典要求每次測試都要進行這項檢查。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是LAL檢驗的一個重要特點。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y-截距只要變化 1%，就會導(dǎo)致內(nèi)毒素測定結(jié)果變化30%至35%。因此，已知為10 EU/mL的樣品，讀數(shù)可能為13.5 EU/mL——這不是因為樣品中的內(nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因為y-截距發(fā)生了變化^[6]。

（四）陰性對照
每次檢測都應(yīng)進行陰性對照。陰性對照是用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的水樣。陰性對照樣品可顯示在制備內(nèi)毒素系列時是否發(fā)生了污染。對照組的內(nèi)毒素含量必須低于標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低內(nèi)毒素濃度（常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)系列為0.05EU/mL）。這項檢查是藥典要求的。

四、總結(jié)
本文探討了影響 LAL 檢測的一些變化來源。對于實驗室用戶來說，了解這些因素非常重要，尤其是在設(shè)計檢測方法和調(diào)查檢測異常時。文章還考慮了一個衡量變異性的關(guān)鍵指標(biāo)：變異系數(shù)。這是實驗室主管在審查測試結(jié)果時需要進行的一項重要檢查。

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