文獻(xiàn)速遞|Blue Pippin全自動(dòng)DNA脈沖場(chǎng)電泳回收儀用于單分子蛋白組學(xué)識(shí)別技術(shù)開(kāi)發(fā)
 

 

【Nature Nanotechnology】Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers
借助DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺繪制單分子蛋白組學(xué)的機(jī)制“指紋”

 

從微量或痕量樣本中鑒定生物分子是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)長(zhǎng)期目標(biāo)。近些年，測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展大大促進(jìn)了DNA分析對(duì)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的推動(dòng)。在蛋白質(zhì)層面，其結(jié)構(gòu)、功能相對(duì)復(fù)雜及無(wú)法實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增，盡管質(zhì)譜法和質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)等方法取得了一定進(jìn)展，但是單分子蛋白質(zhì)鑒定仍然面臨挑戰(zhàn) 。為此，來(lái)自哈佛大學(xué)威斯研究所（Wyss Institute at Harvard University）、哈佛醫(yī)學(xué)院布拉瓦特尼克研究所（Blavatnik Institute at Harvard Medical School）和波士頓兒童醫(yī)院（Boston Children 's Hospital）的科研人員，將DNA納米技術(shù)與單分子力譜相結(jié)合，構(gòu)建了一種DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺（DNA Nanoswitch Caliper ，DNC），能夠以原子分辨率測(cè)量單分子蛋白上的多個(gè)坐標(biāo)�；�于光鑷技術(shù)，可以進(jìn)行DNA和肽的絕對(duì)距離測(cè)量，精度可達(dá)埃米級(jí)。同時(shí)使用多重磁鑷子，進(jìn)行混合蛋白樣本中相對(duì)豐度的量化檢測(cè)。研究小組通過(guò)測(cè)量DNA標(biāo)記殘基之間的距離，對(duì)合成肽和天然肽進(jìn)行了單分子指紋分析，并在異質(zhì)群體中發(fā)現(xiàn)了不同蛋白修飾之間的區(qū)別。DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺是一種功能強(qiáng)大且易于使用的工具，將在單分子蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新的應(yīng)用。
 

圖1. DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺（DNC）繪制單分子指紋圖譜示意圖

DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺（DNC）衍生于DNA納米開(kāi)關(guān)技術(shù)，其本質(zhì)是一條DNA單鏈。在DNA單鏈上存在多個(gè)分子 “手柄”。當(dāng)這些手柄中的兩個(gè)相互結(jié)合時(shí)，會(huì)在DNA單鏈中形成閉環(huán)，且鏈的總長(zhǎng)度縮短。當(dāng)施加力量將手柄拉開(kāi)時(shí)，DNA單鏈就會(huì)延伸恢復(fù)其原來(lái)的長(zhǎng)度。鏈在開(kāi)環(huán)和閉環(huán)狀態(tài)下的長(zhǎng)度差異反映了環(huán)的大小，進(jìn)而反映了手柄之間的距離（圖1）。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)將手柄設(shè)計(jì)成可以與生物大分子結(jié)合的單鏈，進(jìn)而將該技術(shù)推進(jìn)至生物大分子檢測(cè)。手柄可以有效地將分子“夾在”中間，類(lèi)似游標(biāo)卡尺，通過(guò)測(cè)量DNA納米開(kāi)關(guān)在開(kāi)環(huán)和閉環(huán)狀態(tài)下的總長(zhǎng)度差異，有效地測(cè)量生物大分子的大小，形成獨(dú)特的分子指紋。

其中，DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺是通過(guò)連接兩個(gè)修飾的DNA構(gòu)建體而產(chǎn)生的（圖2）。一種DNA構(gòu)建體由pET-26b（+）質(zhì)粒的2820bp區(qū)域PCR擴(kuò)增制備，另一種由環(huán)狀寡核苷酸、5’-地高辛修飾的寡核苷酸（DNC1）和其他鏈（DNC2和DNC3），進(jìn)行退火制備。在構(gòu)建完成后，使用Blue Pippin全自動(dòng)DNA電泳回收儀進(jìn)行目標(biāo)片段（約3kb）的精準(zhǔn)回收，獲得單一目標(biāo)DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺（DNC），無(wú)雜帶，確保后續(xù)DNC指紋功能的正常發(fā)揮。

圖2. DNA納米開(kāi)關(guān)卡尺（DNC）構(gòu)建流程圖

文中首先在單鏈DNA（ssDNA）分子上測(cè)試了DNC技術(shù)，證實(shí)DNC的開(kāi)環(huán)和閉環(huán)狀態(tài)之間的距離變化與目標(biāo)分子的長(zhǎng)度直接相關(guān)。這些長(zhǎng)度變化可以用埃米級(jí)精度（比DNA雙螺旋的寬度小10倍）來(lái)測(cè)量，從而能夠識(shí)別小到一個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度變化。繼而將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上，通過(guò)已知序列的合成肽，發(fā)現(xiàn)手柄之間的距離都與肽中氨基酸長(zhǎng)度的預(yù)期距離相匹配。同時(shí)檢測(cè)一種名稱(chēng)為NOXA BH3的天然線性化肽時(shí)，也得到了類(lèi)似的結(jié)果。更進(jìn)一步研究表明，通過(guò)用一個(gè)磁鑷子系統(tǒng)取代光學(xué)珠，能夠?qū)Χ鄠�(gè)不同的肽進(jìn)行平行測(cè)量，并確定不同分子的相對(duì)濃度。DNC提供了一種強(qiáng)大的方法用于表征納米級(jí)復(fù)合物中的距離和幾何形狀，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、納米技術(shù)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)等多個(gè)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。

原文
Shrestha, Prakash, et al. "Single-molecule mechanical fingerprinting with DNA nanoswitch calipers." Nature nanotechnology 16.12 (2021): 1362-1370.

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