研究背景
Nature：清北團(tuán)隊合作發(fā)現(xiàn)CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生長進(jìn)化模型

CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高�，F(xiàn)有的方法存在著種種局限性，例如優(yōu)化序列可能破壞結(jié)構(gòu)、改變表達(dá)方式可能導(dǎo)致副作用、使用輔助蛋白會增加復(fù)雜性等。因此，開發(fā)新的方法來增強(qiáng)Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系統(tǒng)研究中的一個重要課題。

2024年5月29日，來自清華大學(xué)和北京大學(xué)的研究團(tuán)隊在Nature上合作發(fā)表了題為：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究論文

研究團(tuán)隊通過生物信息學(xué)分析、結(jié)構(gòu)生長軌跡分析、生化實(shí)驗(yàn)、冷凍電鏡解析和大腸桿菌抗噬菌體實(shí)驗(yàn)等手段，發(fā)現(xiàn)了一類新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以顯著增強(qiáng)Cas9核酸酶的活性。研究團(tuán)隊還建立了Cas9核酸酶生長進(jìn)化模型，揭示了Cas9蛋白結(jié)構(gòu)和功能的演變規(guī)律，并闡明了PcrIIC1增強(qiáng)Cas9活性的分子機(jī)制。這項研究為我們進(jìn)一步理解CRISPR系統(tǒng)的進(jìn)化歷程，以及開發(fā)基于CRISPR免疫增效子的高效基因編輯工具奠定了基礎(chǔ)。
 

圖1. 結(jié)構(gòu)生長軌跡分析方法（左）和II-C型Cas9的生長軌跡圖（右）

通過生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來自金黃色細(xì)菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強(qiáng)Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。
 

圖2. 冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結(jié)合的三個階段

蛋白質(zhì)與核酸的分子互作實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合進(jìn)而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強(qiáng)，抗噬菌體免疫性增強(qiáng)。

研究利用溶液中標(biāo)記的分子互作方式獲得親和力，得出與單獨(dú)的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合（圖3a）進(jìn)而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強(qiáng)，抗噬菌體免疫性增強(qiáng)。
 

圖3. PcrIIC1增強(qiáng)CbCas9的DNA結(jié)合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力

最后，為了檢驗(yàn)CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進(jìn)行了抗噬菌體實(shí)驗(yàn)。以上結(jié)果說明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對整個CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)至關(guān)重要。
 

圖4. PcrIIC1顯著增強(qiáng)了CbCas9系統(tǒng)的細(xì)菌免疫活性

FIDA如何更好復(fù)現(xiàn)Nature蛋白與核酸互作發(fā)文思路

流體動力分散技術(shù)（FIDA）通過第一性物理原理直接獲取分子的絕對流體動力學(xué)半徑（R_h），通過追蹤分子微妙的變化來表征生物分子的行為、特征以及功能。Fida Neo分子互作儀涵蓋親和力表征、親和動力學(xué)表征、分子質(zhì)量表征三大功能，一次實(shí)驗(yàn)即可獲得互作與分子質(zhì)控的數(shù)據(jù)，讓互作的數(shù)據(jù)有“法”可依。FIDA技術(shù)無需固定、無需加熱，甚至無需標(biāo)記，可兼容所有緩沖液，是對現(xiàn)有分子互作技術(shù)是一次革命性的升級。

FIDA技術(shù)可用于CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物冷凍電鏡前樣品質(zhì)控，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物與DNA的親和力實(shí)驗(yàn)以及動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，以及CRISPR- cas以及核酸復(fù)合物的大小和定量表征等方面，具體如下:

• FIDA多維蛋白復(fù)合體表征，快速無稀釋優(yōu)化冷凍電鏡樣品，豐富您的蛋白質(zhì)表征數(shù)據(jù)。

FIDA所獲得的R_h為絕對的粒徑大小，可以直接與后期的電鏡數(shù)據(jù)做比較。此外FIDA內(nèi)置的 PDB 關(guān)聯(lián)程序，可以將實(shí)際獲得的 R_h 與數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行比較，有助于結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析。

FIDA技術(shù)單次運(yùn)行只需要40 nL 蛋白質(zhì)在 4 分鐘內(nèi)獲得的完整蛋白質(zhì) QC 圖，包括冷凍電鏡樣品QC的關(guān)鍵參數(shù)表征，例如多分散性指數(shù)（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（R_h）等指標(biāo)，F(xiàn)IDA是一種非常有效的支持所有生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本工具。
 

圖5. FIDA單次測試的得到8個蛋白表征數(shù)據(jù)

冷凍電鏡應(yīng)用：FIDA：4分鐘給您無稀釋的冷凍電鏡樣品優(yōu)化解決方案

• FIDA和本篇研究中應(yīng)用的分子互作技術(shù)都是一種在溶液狀態(tài)下通過熒光分子標(biāo)記表征分子互作的技術(shù)。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白或蛋白與核酸互作的真實(shí)情況。

FIDA 可以使用含鹽和洗滌劑的緩沖液條件，具有不同環(huán)境中（類體內(nèi)環(huán)境）進(jìn)行測試的靈活性。這使得研究者能夠分析不受緩沖液成分限制的核苷酸，以確保其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

FIDA 這種在溶液內(nèi)檢測分子互作技術(shù)，是理想的結(jié)合能力檢測，因?yàn)樗�不依賴于潛在的阻礙性表面固定，不受結(jié)合域空間方向影響的表征。
 

圖6. FIDA實(shí)驗(yàn)原理示意圖

• FIDA不僅可以表征互作親和力，也同時無標(biāo)記檢測CRISPR核酸酶與gDNA相互作用的熱力學(xué)、親和力、和結(jié)合動力學(xué)，全面表征蛋白與核酸互作。

FIDA不僅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合親和力，還可在無標(biāo)記下表征蛋白與核酸的熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合動力學(xué)，甚至表征結(jié)合時蛋白構(gòu)象變化與獲得有關(guān)基因編輯過程的分子細(xì)節(jié)的定量表征。

FIDA技術(shù)可以處理帶負(fù)電荷分析物和帶正電荷配體，使利用FIDA能夠深入了解CRISPR- cas組分之間的結(jié)合相互作用，并以更高的準(zhǔn)確性和效率表征和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)。

FIDA是一種序列無關(guān)的技術(shù)-不需要事先了解序列。FIDA的序列獨(dú)立性質(zhì)可對未知或未表征的基因組區(qū)域進(jìn)行研究，同時簡化工作流程。
 

圖7.(A) FIDA實(shí)驗(yàn)示意圖。ReporterRNA用于識別RNP的大小和飽和點(diǎn)(上)，用其報告RNP結(jié)構(gòu)作為競爭分析的起點(diǎn)(下);(B)正向結(jié)合(上)和反向滴定(下)期間獲得的原始FIDA數(shù)據(jù);

本研究在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次發(fā)現(xiàn)了一類新型的CRISPR免疫增效子可以通過二聚化Cas9效應(yīng)器提升Cas9活性，這些結(jié)果不僅有助于我們進(jìn)一步理解CRISPR系統(tǒng)的進(jìn)化歷程，還為未來基于CRISPR免疫增效子的高效基因編輯工具的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

FIDA對于蛋白質(zhì)復(fù)合體的多維表征和對蛋白與核酸互作親和力與動力學(xué)的的檢測，不依賴于分子量變化，樣本用量少（僅需40nL），是一種在溶液狀態(tài)下且不受緩沖液成分影響的多維表征技術(shù)。對于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)互作的真實(shí)情況。