使用Advanced BioMatrix的TeloCol-10進行生物打印球狀體時，TeloCol-10相比Matrigel在更長的孵育時間內(nèi)表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

1 文章
Title：“High-throughput Spheroid Formation and Migration with T eloCol-10 for Improved  Stability”

作者：Paulo Godoy, PhD; Itedale Namro Redwan, PhD Gothenburg, Sweden

摘要：1型膠原蛋白和Matrigel是3D細胞培養(yǎng)的金標準，最近被用于3D生物打印研究。然而，關于天然基質(zhì)在高通量球體形成和遷移的生物打印模型上的可擴展性，仍然存在認知差距。在該案例中，我們證明了在相同條件下，與Matrigel相比，1型膠原蛋白(在本例中為TeloCol®-10)在更長的孵育時間內(nèi)支持乳腺癌細胞球形形成和遷移，具有更高的穩(wěn)定性。盡管Matrigel是促進細胞生長和遷移的金標準，但在介質(zhì)交換過程中，液滴很容易分離，并且在測試條件下，隨著時間的推移，可以觀察到降解的跡象。

2 前言
在天然基質(zhì)中，膠原蛋白和Matrigel被認為是3D細胞培養(yǎng)的黃金標準，因為它們能夠模擬體內(nèi)細胞-細胞基質(zhì)(ECM)的相互作用。Matrigel具有膠原蛋白和其他天然水凝膠的許多優(yōu)點，已被用于研究細胞遷移、血管生成和腫瘤發(fā)展(Kleinman, 2005)。它來源于Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤分離的ECM，含有層粘連蛋白、4型膠原蛋白、腸動蛋白，以及幾種生長因子、細胞因子和許多其他低豐度的肽/蛋白，通過蛋白質(zhì)組學分析鑒定，達到1851個蛋白(Hughes, 2010)。除了Matrigel的多功能性外，還有一些缺點限制了它在藥物發(fā)現(xiàn)和疾病建模中的應用，包括成分的高批次差異(Hughes, 2010)，腫瘤生長因子/肽可能不是所有器官或疾病的最佳選擇(Mahoney, 2008)，對機械性能的控制較差，以及樣品的不均勻剛度(Reed, 2009)。

另外，膠原蛋白支持3D細胞培養(yǎng)，不含Matrigel所含的癌源性生長因子和細胞因子。膠原蛋白是天然組織的主要有機成分，在已確定的29種類型中，1型膠原蛋白最為常見(Shoulders, 2009)。由于其結構特性、生物相容性、滲透性和可降解性，膠原基水凝膠是復制組織發(fā)育、再生和腫瘤生物學的理想選擇(Sapudom, 2018)。

TeloCol-10含有95%的1型膠原蛋白和5%的3型膠原蛋白(都來自牛)。它保留了端肽區(qū)域，從而增加了硬度，這在培養(yǎng)中比不含端肽的膠原蛋白提供了更多的穩(wěn)定性。更穩(wěn)定的水凝膠可能有利于諸如基于液滴的球體形成和遷移分析等應用，這些應用需要更長的孵育時間，因為在添加藥物之前和之后的幾天內(nèi)需要監(jiān)測細胞行為。此外，通過改變TeloCol-10濃度，可以調(diào)節(jié)其硬度以模擬不同的生理條件。其他研究估計乳腺癌基質(zhì)的硬度約為400至1500 Pa，而正常乳腺組織的硬度約為150 Pa (Cox, 2011)， TeloCol-10的6 mg/mL(≈1200 Pa)和4 mg/mL(≈230 Pa)也得到了類似的值(圖1)。Matrigel稀釋至6 mg/mL時僅達到50 Pa (Slater, 2021)。
 

圖1所示：TeloCol-10稀釋為6和4mg /mL的儲存模量
 

3D生物打印革命使得在微孔板中創(chuàng)建可復制的3D模型成為可能(Blanco-Fernandez, 2021)。然而，關于天然基質(zhì)在生物打印液滴上的可擴展性和穩(wěn)定性，用于高通量球體形成和遷移，以及它們在藥物發(fā)現(xiàn)和腫瘤生物學研究中的應用，還有更多的需要了解。

在本應用報告中，我們比較了1型膠原(TeloCol-10)和Matrigel對乳腺癌細胞系MDA-MB-231的球體形成和遷移的影響，MDA-MB-231因其侵襲性而常用于晚期乳腺癌的建模。

我們使用CYTENA的CELLCYTE X™活細胞成像系統(tǒng)生物打印了攜帶細胞的TeloCol-10或Matrigel液滴，并在5天內(nèi)監(jiān)測球體的形成，該系統(tǒng)還用于監(jiān)測生物打印的液滴結構中細胞從內(nèi)核向外無細胞層的遷移(圖2)。
 

圖2. TeloCol-10 或 Matrigel 的3D生物打印的類球體（液滴）和遷移（液滴中液滴）模型及其分析的一般工作流程。

3 材料和方法
3.1 細胞培養(yǎng)
使用mCherry標簽標記MDA-MB-231(ATCC,HTB-26)細胞，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含：10% FBS、1% 青鏈霉素（雙抗）；培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5% CO2、95% 的濕度。

細胞在與兩種生物墨水嵌合混合之前要先培養(yǎng)到致密單層。保持細胞活率在90% 以上。

細胞無論是與TeloCol-10還是與Matrigel混合，細胞的終濃度保持一致（4×106細胞/ mL）。

3.2 打印前準備
對于每種水凝膠，使用兩種不同的濃度：6 mg/mL用于球體形成實驗和遷移實驗的內(nèi)部液滴，4 mg/mL用于遷移實驗的外部液滴。在均質(zhì)步驟之前，所有材料都保存在冰上。

為了從TeloCol-10(10 mg/mL)中獲得4和6 mg/mL的終濃度，根據(jù)制造商的方案對溶液進行中和和稀釋。Matrigel(10.3 mg/mL)僅用細胞懸液稀釋。將水凝膠與細胞懸浮液用2支3ml注射器混合，來回混合30次。

3.3 生物打印的流程
將含有細胞的TeloCol-10或Matrigel的注射器用22G錐形噴嘴蓋住，裝入CELLINK內(nèi)部開發(fā)的生物分配器（BIO ONE）中，該分配器帶有遇冷打印頭（2℃），并附有隔熱層。

將用于組織培養(yǎng)的96孔板放在打印床上。

球體實驗中，將細胞包埋在6mg /mL的TeloCol-10或Matrigel溶液中，打印1 µL液滴。

遷移實驗中，將細胞包埋在6 mg/mL的TeloCol-10或Matrigel中，打印1 μL液滴（內(nèi)滴）。打印液滴后，立即將板置于37°C加濕培養(yǎng)箱中約15分鐘，用于TeloCol-10的熱交聯(lián)。Matrigel板孵育25分鐘。第一滴凝膠后，外滴(5 µL)用4 mg/mL的TeloCol-10或Matrigel打印，在培養(yǎng)箱內(nèi)重復熱凝膠。每孔加入300 µL培養(yǎng)基，孵育至下游分析。每3天用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。

3.4 活細胞成像
CELLCYTE X是一種高通量活細胞成像系統(tǒng)(具有3個熒光通道和亮場)，可以實時監(jiān)測細胞活力，長期孵育。我們實現(xiàn)了球體分析模式，它可以適應于膠原蛋白或基質(zhì)嵌入細胞。在打印的液滴中加入培養(yǎng)基后，將孔板置于CELLCYTE X中孵育30分鐘，然后開始成像，以減少冷凝。CELLCYTE Studio設置為每隔3小時以4倍放大率捕獲每孔的亮場和紅色熒光，持續(xù)5天。

3.5 分析
對于球體形成試驗，編譯了總紅色熒光數(shù)據(jù)。將特定時間點的紅色熒光歸一化為時間0的初始紅色熒光。這種歸一化使得比較膠原蛋白和Matrigel結果成為可能。TeloCol-10分析了59個液滴，Matrigel分析了52個液滴。通過比較TeloCol-10或matrigel包埋細胞在12個構建體中的不同遷移模式來分析遷移實驗。

4 結果與討論
4.1 腫瘤球的生物打印
從第1天到第5天，用CELLCYTE X成像液滴，在4倍放大下捕獲亮場和紅色熒光圖像。乳腺癌細胞在TeloCol-10中持續(xù)生長，第3天形成聚集體和球狀體，并持續(xù)生長至第5天(圖3A)。

在Matrigel(圖3B)中，細胞在第2天聚集成球體。從第3天開始，Matrigel液滴開始在邊緣降解，將細胞團推向中心，同時使細胞在孔上生長。在第4天和第5天，所有的小球體簇已經(jīng)合并成一個大的中心簇，而附著在孔板上的細胞已經(jīng)過度生長，占據(jù)了大部分的孔面積。有趣的是，整個過程中每3小時捕獲的紅色熒光顯示，Matrigel和TeloCol-10中的細胞生長速度相同(圖4)。
 

圖4. 含有MDA-MB-231 mCherry細胞的TeloCol-10 (6mg /mL)和Matrigel (6mg /mL)液滴的相對紅色熒光分析。

細胞從第1天到第5天由CELLCYTE X系統(tǒng)監(jiān)測，使用亮場和紅色熒光在4倍放大下獲得圖像。相對熒光(Ft/Fi)。Ft:特定時間的總紅色熒光;Fi:時刻0的總紅色熒光。

對于藥物測試方案，細胞通常在打印后3至7天進行處理，此時3D結構形成相對穩(wěn)定。在這里，我們演示了TeloCol-10對于這種特定設置具有更高的穩(wěn)定性。為了進一步評估Matrigel或TeloCol-10在更復雜的細胞模型中的影響，我們采用了使用兩種不同水凝膠剛度的遷移方案。

4.2 癌細胞在不同基質(zhì)中的侵襲
我們采用了先前測試過的滴對滴的方法來研究不同水凝膠濃度的影響。該試驗需要一個嵌入細胞的核心液滴，由一個無細胞的外層液滴覆蓋(Takata, 2009;扎曼,2006)。在本實驗中，我們將含有4x106個細胞/mL的1µL的TeloCol-10(6 mg/mL)或Matrigel(6 mg/mL)滴生物打印到96孔板中，以形成嵌入細胞的中心核心。第一滴聚合后，在核心滴上打印第二滴無細胞的TeloCol-10(4 mg/mL)或Matrigel(4 mg/mL)。用CELLCYTE X每3小時跟蹤一次遷移模型，持續(xù)9天(圖5)。

3天后，可以觀察到細胞從TeloCol-10和Matrigel的內(nèi)液滴向無細胞的外液滴的初始遷移，隨后幾天出現(xiàn)大規(guī)模遷移。此外，當細胞遷移出去時，內(nèi)層的降解使中心形成球狀簇，就像在球體模型中觀察到的降解一樣。在第7天，Matrigel的外層也開始降解和收縮，移動到相同的中心區(qū)域，并留下附著在孔底的細胞軌跡�？偟膩碚f，我們能夠在TeloCol-10模型中跟蹤遷移細胞長達9天，而Matrigel模型中的細胞在第7天就到達了外層的邊界。
 

圖5. 癌細胞遷移的滴對滴模型。內(nèi)核中含有活的MDA-MB-231 mCherry(4×106個細胞/mL，紅色)，包埋在1µL液滴中的A)TeloCol-10(6 mg/mL)或B) Matrigel(6 mg/mL)中，然后用5 µL無細胞的TeloCol-10或Matrigel(4 mg/mL)覆蓋內(nèi)液滴。細胞用CELLCYTE X系統(tǒng)(4倍亮場和紅色熒光)監(jiān)測9天。液滴降解僅在Matrigel中明顯。

在球體形成和遷移實驗中，Matrigel的降解與生長細胞的蛋白質(zhì)水解消化有關，且小液滴體積、高水凝膠濃度和高細胞濃度可能促進降解。薄層中的Matrigel會形成異常結構，細胞生長傾向于單層。此外，Matrigel的蛋白質(zhì)和生長因子組成變化會影響其機械性能、細胞生長、遷移和實驗可重復性。在更換介質(zhì)或添加藥物時，Matrigel液滴會從孔底分離，而TeloCol-10液滴則穩(wěn)定粘附在孔中心。TeloCol-10的穩(wěn)定性歸因于其適中的硬度和額外的交聯(lián)點（TeloCol-10保留了膠原蛋白的端肽區(qū)域），以及超過99%的純度，而Matrigel含有多種活性生長因子，可能影響細胞活動，需謹慎解釋其結果。

5 結論
* 在相同濃度下，TeloCol-10與Matrigel具有相似的生長速率，可促進乳腺癌球體的形成和遷移。
* 在腫瘤球體實驗中，6 mg/mL的Matrigel在4天后出現(xiàn)降解，在癌細胞遷移實驗中，內(nèi)滴(6 mg/mL，含細胞)和外滴(4 mg/mL，不含細胞)在6和7天后出現(xiàn)降解。在兩種試驗中，TeloCol-10均未顯示出降解跡象。
* 與Matrigel相比，TeloCol-10的高硬度膠原蛋白在更長的培養(yǎng)時間內(nèi)保持液滴結構穩(wěn)定，并且含有更少的生長因子，這使得TeloCol-10成為高通量生物打印的更好選擇。

6 參考文獻
見網(wǎng)址：
https://go.pardot.com/l/894101/2022-04-04/49b9sw/894101/1649077362zEhwPlOq/AppNote_TeloCol_10_CELLCYTE_Biodispenser_20220404.pdf