·4分鐘，高通量，40nL樣品，無稀釋，多維質(zhì)控優(yōu)化冷凍電鏡樣品·
冷凍電鏡發(fā)展難題：不能忽略的樣品制備技術(shù)
冷凍電鏡（Cryo-Electron Microscopy）解析生物分子結(jié)構(gòu)在過去的十年間迅速成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域中一種極具吸引力的方法。隨著Cryo-EM的爆炸式普及，樣品制備必須與時俱進(jìn)，以防止工作流程中斷，導(dǎo)致反復(fù)耗時的的實(shí)驗(yàn)過程。

目前，樣品制備已成為工作流程中的主要障礙，部分結(jié)構(gòu)生物學(xué)科學(xué)家和工程師將研究方向鎖定在解決這一難題上。

隨著研究的樣品越來越異質(zhì)化和復(fù)雜化，研究者需要更繁瑣的優(yōu)化流程以及更高的研究成本。雖然優(yōu)化樣品的技術(shù)層出不窮，但每種方法的效果因樣品而異。目前，很多樣品優(yōu)化的結(jié)果主要取決于用戶的專業(yè)知識和經(jīng)驗(yàn)，這一過程可能會變得越來越耗時和具有挑戰(zhàn)性。

樣品優(yōu)化和負(fù)染載網(wǎng)制備過程中會遇到許多變量，尤其是每個流程中都需要對樣品進(jìn)行稀釋，因此很難確定因果關(guān)系。研究人員只能在電鏡下對樣品進(jìn)行分子水平的評估。雖然一次制備載網(wǎng)的過程不需要太多時間，但為獲得合適的條件而進(jìn)行的反復(fù)試驗(yàn)卻耗時耗力。從實(shí)際情況來看，這使得實(shí)驗(yàn)方案難以標(biāo)準(zhǔn)化。

為了簡化目前的冷凍電鏡樣品制備流程，我們需要一種高通量，快速的，在無稀釋條件下直接表征樣品穩(wěn)定性的技術(shù)手段。FIDA是一種基于第一性原理直接表征分子絕對水動力學(xué)半徑的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)無稀釋，高通量，多維度表征樣品的穩(wěn)定性，是全新的樣品質(zhì)控解決方案。

評估樣品優(yōu)化參數(shù)多，一個完整流程往往需要多種儀器，每個流程中都需要對樣品進(jìn)行稀釋，很難確定因果關(guān)系，導(dǎo)致高成本長時間優(yōu)化后仍然不能得到完美的冷凍電鏡結(jié)果。

英國知名的蛋白質(zhì)科學(xué)服務(wù)公司PEAKProtein，使用FIDA對蛋白質(zhì)進(jìn)行全面QC分析，相較于傳統(tǒng)QC方法，效率、精度及成本得到全面提升和改善，目前已經(jīng)將FIDA技術(shù)全面應(yīng)用于冷凍電鏡相關(guān)技術(shù)的服務(wù)流程。實(shí)現(xiàn)了對原有采用SDS-PAGE、FSEC、負(fù)染的流程進(jìn)行了優(yōu)化。
 

FIG1.FIDA的冷凍電鏡解決方案，從小規(guī)模構(gòu)建，放大生產(chǎn)質(zhì)控與樣品優(yōu)化全流程都大部分工作可直接通過FIDA完成，尤其是無稀釋的樣品優(yōu)化，可大大提高得到高質(zhì)量冷凍電鏡數(shù)據(jù)成功率。
 

表1：蛋白質(zhì)量表征技術(shù)比較

難題2 影響冷凍電鏡結(jié)果質(zhì)量因素很多，需要在樣品制備與優(yōu)化時采用多維度數(shù)據(jù)評估
FIDA技術(shù)單次運(yùn)行只需要40 nL 蛋白質(zhì)在 4 分鐘內(nèi)獲得的完整蛋白質(zhì) QC 圖，包括冷凍電鏡樣品QC的關(guān)鍵參數(shù)表征，例如多分散性指數(shù)（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（R_h）等指標(biāo)，F(xiàn)IDA是一種非常有效的支持所有生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本工具。

其中需要強(qiáng)調(diào)的是FIDA不僅可以看到溶液中的蛋白質(zhì)，還可以看到可溶性和不可溶性聚集體，并可以量化后者，而且可以確定寡聚狀態(tài)并實(shí)際計算二聚化的 K_d。

FIDA所獲得的R_h為絕對的粒徑大小，可以直接與后期的電鏡數(shù)據(jù)做比較。此外FIDA內(nèi)置的 PDB 關(guān)聯(lián)程序，可以將實(shí)際獲得的 R_h 與數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行比較，有助于結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析。

FIG2. FIDA單次測試的8個質(zhì)控參數(shù)

難題3 膜蛋白難以純化，需要用去垢劑溶解，但有效提取膜蛋白的去垢劑不一定適用于冷凍電鏡，需要高通量快速方法優(yōu)化膜蛋白增溶條件

納升級樣品高通量膜蛋白的去垢劑增溶條件篩選

FIG3.用40nL的GFP標(biāo)記的Lac-Y蛋白座位指示劑，采用11種不同去垢劑方案對蛋白溶解程度和PDI指數(shù)檢測
 

FIG4.FIDA檢測在11種去垢劑的GFP-LacY熒光信號峰值圖和直方圖

將FIDA檢測的在不同11種去垢劑的GFP-LacY峰值圖信號疊加，其中峰面積代表了溶解蛋白的濃度，將峰值面積整理成直方圖顯示了去垢劑溶解蛋白的能力。

FIG5.11種去垢劑中的GFP-LacY多分散指數(shù)（PDI）
 

FIG6.11種去垢劑中的GFP-LacY增溶效果排序

FIDA再根據(jù)峰值的形狀計算了了不同去垢劑中蛋白的多分散指數(shù)（PDI），可確定樣品是否在去垢劑中呈單分散狀態(tài)，這是評估樣品是否適合高質(zhì)量單粒子冷凍電鏡的關(guān)鍵指標(biāo)。最后綜合樣品在去垢劑中的溶解度和PDI進(jìn)行對不同組合排序可以得到最優(yōu)的組合，并且最終結(jié)果與FSEC方法一致。

難題4 聚合蛋白低聚條件的條件高通量篩選

FIG7.aSOs-Alexa488樣品在12種添加不同化合物緩沖液中的低聚物與單體比例

FIDA高通量評估在加入12種不同化合物緩沖液中預(yù)孵育后，aSOs-Alexa488樣品聚合和單體的Rh和比例，在復(fù)合體/聚集體樣品的制備和優(yōu)化中可評估緩沖液體系是否能維持樣本有活性的聚合狀態(tài)。
 

FIG8. 膜蛋白在不同pH值、離子強(qiáng)度、溫度、血漿濃度等條件下篩選

有一些蛋白在冷凍電鏡前需要正確組裝并保證其生物活性，例如一些藥物靶點(diǎn)蛋白，以二聚體或多聚體的形式保持活性狀態(tài)，或者某些蛋白復(fù)合物分子，很多情況下需要復(fù)雜的緩沖液優(yōu)化或者需要在血漿、配體或細(xì)胞裂解液的環(huán)境中，這使得我們對樣品制備質(zhì)控時需要在多條件和復(fù)雜條件下對樣品進(jìn)行評估。

FIDA通過獨(dú)有的流體誘導(dǎo)分子擴(kuò)散原理，可實(shí)現(xiàn)對于分子的全面和絕對的質(zhì)量表征，其極佳的靈敏度和分辨率只需少量的樣品消耗，通過全自動進(jìn)樣系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高通量的無人值守操作。FIDA的第一性原理的單平臺多參數(shù)功能極大提升了復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)出效率，其對不同樣品的兼容性有望成為一款基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究利器。