2009年，Hans Clevers及其團(tuán)隊成功利用小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出了第一個腸道類器官，從而揭開了類器官研究的新篇章。類器官的培養(yǎng)過程涉及成體干細(xì)胞（TSCs）或多能干細(xì)胞（PSCs）在體外進(jìn)行3D培養(yǎng)，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織模擬物，其結(jié)構(gòu)和功能類似于真實器官，這有助于提高藥物研發(fā)的成功率。未來借助AI技術(shù)與類器官的聯(lián)合應(yīng)用，藥物篩選將變得更為高效和精準(zhǔn)。

眾所周知，人類大腦發(fā)育是一個復(fù)雜而精密的過程，不僅與神經(jīng)祖細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)張有關(guān)，還需要同時建立一個多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)。理論上，不斷擴(kuò)大的類器官可以直接從多個體組織細(xì)胞中生長，但到目前為止，腦類器官只能從多能干細(xì)胞中建立。2024年1月，類器官鼻祖Hans Clevers教授與Benedetta Artegian教授團(tuán)隊在CELL上聯(lián)合發(fā)表了“Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids”一文。該研究直接從人胎兒腦組織中培育出體外自組織的大腦類器官，命名為FeBOs（Fetal brain in vitro self-organizes into organoids）。這種實驗室培養(yǎng)的類器官不僅創(chuàng)立了研究大腦發(fā)育的全新模式，還為深入探討大腦發(fā)育相關(guān)疾病，如腦腫瘤的發(fā)展和治療，提供了有價值的新途徑。

首先，研究人員從人類胎兒腦組織中分離出神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs），這些細(xì)胞以單層或3D細(xì)胞聚集物的形式生長；同時，若將組織切成小塊，并在無血清和無細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也能形成有組織的3D結(jié)構(gòu)，稱之為胎兒衍生腦類器官（FeBOs）。超過95%的FeBOs系可通過切割整個類器官樣體進(jìn)行傳代，每個切割片段都能重新形成完整的類器官樣體，提高了FeBOs系的可重復(fù)性，為下游應(yīng)用提供了穩(wěn)定的擴(kuò)增。隨后，研究人員利用標(biāo)志基因評估FeBOs的細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)外圍富含神經(jīng)干/祖細(xì)胞（SOX2⁺），而中心則分布神經(jīng)元細(xì)胞（TUJ1⁺, DCX⁺, NeuN⁺）。細(xì)胞組成定量分析顯示，F(xiàn)eBOs內(nèi)細(xì)胞的可再生豐度和異質(zhì)性。通過慢病毒感染完整的FeBOs，研究人員評估了細(xì)胞系動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量隨時間增加，支持正在進(jìn)行的神經(jīng)發(fā)生。此外，轉(zhuǎn)錄組分析還揭示了FeBOs獨(dú)特的神經(jīng)外胚層特征。

圖1 人胎兒腦自組織類器官的建立

為研究是否能夠培養(yǎng)具有人腦區(qū)域特異性的FeBOs，檢驗其在體外是否能保持內(nèi)在組織特性，研究團(tuán)隊成功建立了背側(cè)和腹側(cè)FeBOs系，并通過qPCR檢測標(biāo)志物的表達(dá)。隨后，免疫熒光表征進(jìn)一步顯示了FeBOs的區(qū)域特異性，同時單細(xì)胞RNA測序分析也進(jìn)一步揭示了FeBOs與人胎兒腦組織細(xì)胞的相似性。

圖2 FeBOs與人胎兒腦組織的細(xì)胞相似性

越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和ECM-細(xì)胞相互作用在調(diào)節(jié)人類大腦發(fā)育中的特異性擴(kuò)張方面起著至關(guān)重要的作用。通過與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)比較，他們發(fā)現(xiàn)大腦ECM關(guān)鍵成分在轉(zhuǎn)錄組-蛋白質(zhì)組表達(dá)上呈現(xiàn)出良好的一致性。分泌蛋白組的結(jié)果顯示，持續(xù)的組織完整性有助于生成ECM生態(tài)位，而ECM生態(tài)位可能反過來促進(jìn)FeBOs在組織結(jié)構(gòu)中的持續(xù)擴(kuò)張，使研究人類大腦發(fā)育中的功能性ECM成為可能。

鑒于來源于組織的類器官具備迅速擴(kuò)張的潛力，研究團(tuán)隊深入研究了這些類器官在模擬腦癌方面的潛能。在本文中，研究團(tuán)隊利用NEPA21成功將piggyBac質(zhì)粒、CAG-EGFP質(zhì)粒、sgRNA質(zhì)粒和mCherry-Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胎兒腦類器官中，實現(xiàn)了FeBOs的熒光標(biāo)記和基因編輯。結(jié)果顯示，經(jīng)過3個月的培養(yǎng)，具有TP53基因缺陷的細(xì)胞數(shù)量完全超過了類器官中的健康細(xì)胞，表明該FeBOs突變株具備癌細(xì)胞異常增殖的特性。這一研究提供了先進(jìn)的類器官模型，為深入了解大腦發(fā)育和相關(guān)疾病提供有力工具，對神經(jīng)科學(xué)研究和疾病治療具有重要。

圖3 FeBOs支持穩(wěn)定的腫瘤建模

值得關(guān)注的是，腫瘤類器官模型的建立依賴于穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)染方法。有報告指出，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在腸道類器官中的轉(zhuǎn)染效率不足10%。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，但是病毒隨機(jī)整合到宿主中具有潛在的誘變性。電穿孔法不僅可以實現(xiàn)類器官60%或更高的轉(zhuǎn)染效率，同時也具備更高的生物安全性。

NEPA21電轉(zhuǎn)染儀是由日本NEPAGENE品牌推出的一款先進(jìn)的電穿孔設(shè)備，其獨(dú)特的四步法電轉(zhuǎn)程序極大地提升了類器官轉(zhuǎn)染的效率，使其成為類器官轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的首選解決方案。自2015年起，Hans Clevers教授及其合作團(tuán)隊便使用NEPA21進(jìn)行類器官轉(zhuǎn)染，至今已經(jīng)在腸道、肝臟、乳腺組織、子宮內(nèi)膜和大腦等多種組織類器官中成功實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)染及編輯。

NEPA21電穿孔類器官體系及參數(shù)總結(jié)如下：

人胎兒腦類器官

人乳腺組織類器官

人胎兒肝臟類器官

人腸道類器官

圖4 類器官電穿孔基本流程

了解更多類器官電轉(zhuǎn)染實驗操作及參數(shù)設(shè)置請來電咨詢或查閱NEPAGENE官網(wǎng)類器官應(yīng)用文獻(xiàn)：

https://nepagene.jp/en/applications/electroporation-e/cell-cultures-e/transfection-into-organoids-by-electroporation

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計的電轉(zhuǎn)程序，配合專利的電壓衰減設(shè)計，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、外泌體、類器官、活體動物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻(xiàn)中，是進(jìn)行細(xì)胞懸浮/貼壁狀態(tài)、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

 參考文獻(xiàn) 

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◀Fujii M, Matano M, Nanki K, et al. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation[J]. Nature protocols, 2015, 10(10): 1474-1485. https://www.nature.com/articles/nprot.2015.088