光片顯微鏡可以做到快速三維成像，同時(shí)其光毒性相較于共聚焦或多光子成像降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)，使針對(duì)活體的長(zhǎng)時(shí)間成像成為可能。光片顯微鏡可以根據(jù)不同的應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行定制，迅速在生物學(xué)研究中普及，用于胚胎發(fā)育學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤學(xué)等多領(lǐng)域，是活體長(zhǎng)時(shí)間三維成像的巨大進(jìn)步。

光片顯微鏡由于具有強(qiáng)大的光學(xué)層切能力、較快的成像速度和較低的光損傷，成為三維成像的重要工具。光片顯微鏡通常利用兩個(gè)垂直放置的物鏡分別進(jìn)行照明和成像，這帶來(lái)了對(duì)樣品的空間限制并禁用了高數(shù)值孔徑的成像物鏡。以?xún)A斜平面照明和微鏡微器件反射技術(shù)為代表的單物鏡光片顯微技術(shù)突破上述限制，展示出在高分辨率和體積高速成像方面的優(yōu)勢(shì)，并且可與超分辨顯微術(shù)等多種技術(shù)結(jié)合，在近年來(lái)取得了巨大發(fā)展。

本文介紹了不同類(lèi)型的單物鏡光片顯微成像技術(shù)的原理、關(guān)鍵性能的提升和其在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。

1.1 傾斜平面照明顯微鏡的實(shí)現(xiàn)原理

傳統(tǒng)的選擇平面照明顯微鏡由兩個(gè)正交的物鏡構(gòu)成，雙物鏡的放置占用了幾何空間，不適用于蓋玻片樣品的成像。使用一物鏡引入光片的同時(shí)使用另一個(gè)相同物鏡進(jìn)行成像則可以解決上述問(wèn)題。Konopka等設(shè)計(jì)了可變角度的落射光熒光顯微鏡，使用與成像同一個(gè)高NA的物鏡輸出可變角度的傾斜照明光，減少了熒光背景，提高了信噪比。

Tokunaga等利用高度傾斜和層壓光學(xué)片顯微鏡，使用細(xì)的傾斜光束對(duì)細(xì)胞中的單個(gè)分子進(jìn)行成像。這樣斜入射的照明光可以增加圖像的對(duì)比度，降低了光漂白程度，但這種顯微鏡照明光束從物鏡光瞳邊緣入射，照明方向與焦平面成一定傾斜角度，由于傾斜面像差的存在，真正能用于成像的只有焦平面與照明光束所相交的那條“線(xiàn)”，而不是面。

圖1 傾斜平面照明顯微鏡光路，用同一物鏡生成光片并成像，引入遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)修正照明角度傾斜

為了解決傾斜照明平面與焦平面不重合的問(wèn)題，2008年Dunsby發(fā)明了傾斜光片照明顯微鏡。如圖1所示，將柱透鏡生成的片狀照明光引入原先探測(cè)物鏡的光路中，在成像光路中設(shè)計(jì)了一種遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)，引入二級(jí)和三級(jí)物鏡在無(wú)球差的條件下對(duì)樣本三維信息在第二、第三物鏡之間進(jìn)行復(fù)制，再通過(guò)三級(jí)物鏡進(jìn)行成像。兩臺(tái)顯微鏡提供的總放大倍數(shù)在軸向和橫向上都是相等的（折射率匹配）。

1.2 傾斜平面照明顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

光片顯微鏡自出現(xiàn)以來(lái)，依靠極低的光毒性常被用于活體胚胎等大樣本的長(zhǎng)時(shí)間發(fā)育成像等。光片顯微鏡的成像限制也成了研究人員開(kāi)發(fā)單物鏡光片的初衷，單物鏡光片顯微鏡的發(fā)展不僅增加了生命科學(xué)研究人員的使用便利性，也拓展了生命科學(xué)中多種之前不可能實(shí)現(xiàn)的場(chǎng)景中的應(yīng)用，使光片顯微鏡在活體成像上的優(yōu)勢(shì)更為明顯。

圖2 傾斜平面照明顯微鏡用于快速生命活動(dòng)成像。（a）OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟中鈣火花的3D成像；（b）OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌收縮鈣波傳播的觀(guān)測(cè)；（c）SCAPE 2. 0以321volume/s的體積成像速度實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟與心房間的血流動(dòng)力學(xué)觀(guān)測(cè)

圖3 OPM在生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)檢查場(chǎng)景的廣泛應(yīng)用。（a）OPM的高分辨率成像；（b）OPM用于流式細(xì)胞檢測(cè)；（c）DaXi-OPM實(shí)現(xiàn)對(duì)9個(gè)斑馬魚(yú)胚胎的同時(shí)成像；（d）Medi-SCAPE用于活體腫瘤檢測(cè)；（e）利用人眼作為天然物鏡，實(shí)現(xiàn)對(duì)眼底視網(wǎng)膜成像

單物鏡光片顯微鏡將振鏡掃描的方式帶入光片顯微鏡的三維成像，將體積成像速度帶入新的量級(jí)，使體積成像可以只受相機(jī)幀速限制。這在很多高速生命活動(dòng)如神經(jīng)活動(dòng)、心臟跳動(dòng)及血流動(dòng)力學(xué)等方向需要毫秒級(jí)時(shí)間分辨率的觀(guān)測(cè)是充滿(mǎn)希望的。

基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡

傾斜平面顯微鏡是最普遍的單物鏡的光片顯微鏡，但是存在傾斜切面引入非各向同性的PSF、需要額外的遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)的問(wèn)題，這使顯微鏡結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。除了傾斜照明平面顯微鏡，另一類(lèi)的單物鏡光片顯微鏡則借用了45°反射微鏡，這一類(lèi)光片顯微鏡用同一物鏡發(fā)射垂直于光軸的照明光片，可以用CMOS/CCD直接成像，不再需要額外的遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)。

2.1 針尖微懸臂反射鏡

早先原子力顯微鏡懸臂的45°鏡面的反射可以使光片與焦平面對(duì)準(zhǔn)。2013年Gebhardt等開(kāi)發(fā)了一款利用原子力顯微鏡（AFM）臂的反射型光片顯微鏡，斜入射的光片在壁上反射照明樣品。受到懸臂反射的啟發(fā)，2018年P(guān)onjavic等利用原子力顯微鏡的單臂開(kāi)發(fā)了一種只使用一個(gè)物鏡的光片顯微鏡，將原子力顯微鏡的單臂當(dāng)作反射界面，也實(shí)現(xiàn)了單物鏡光片照 明。Li等將AFM的顯微鏡單物鏡光片與納米移液器結(jié)合，進(jìn)行了精確單分子遞送研究。這一類(lèi)顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是可以使用高NA物鏡對(duì)多孔板進(jìn)行成像，并且在移動(dòng)位移臺(tái)時(shí)不需要對(duì)樣品進(jìn)行重新聚焦。

2.2 微流控制備微反射鏡器件

2015年Galland等設(shè)計(jì)了一款不需要遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)、光片方向垂直于物鏡光軸的單物鏡光片顯微鏡，該單物鏡光片顯微鏡的光路如圖8（a）所示。該顯微鏡使用了一種定制的樣品裝載容器，將45°反射微鏡結(jié)合在硅片的微孔里。照明光束從物鏡后焦面上斜入射，經(jīng)45°微鏡反射后形成垂直于光軸的照明光片。該單物鏡光片顯微鏡可以與倒置商用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡兼容，同時(shí)10×到100×物鏡都可以使用，生成的光片厚度為1.5~5.2µm，可以方便多種尺度的研究。該系統(tǒng)既可以使用振鏡掃描光片，如圖4（a）所示y方向振鏡掃描，也可以使用柱透鏡生成靜態(tài)光片。

圖4 微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡。（a）基于45°微鏡的單物鏡光片顯微鏡的光路，右上角為掃描電子顯微圖像；（b）利用ETL進(jìn)行軸向位移，使光片中心橫向位置保持不變
 

單物鏡光片顯微鏡的超分辨成像拓展

超分辨顯微術(shù)是一種突破傳統(tǒng)顯微鏡分辨率極限的技術(shù)，可以將物體結(jié)構(gòu)的分辨率提高到亞細(xì)胞水平。現(xiàn)代的超分辨顯微術(shù)包括了多種技術(shù)，如激光受激發(fā)射顯微術(shù)（STED）、包括stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）和NA-based point accumulation for imaging in nanoscale topography（PAINT-DNA）等的單分子光學(xué)顯微術(shù)（SMLM）、結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)（SIM）。依據(jù)瑞利判據(jù)可分辨的最小范圍為200nm，而超分辨顯微鏡的出現(xiàn)突破了該極限，超分辨顯微鏡是近代光學(xué)顯微鏡中最濃墨重彩的一筆。光片的照明方式對(duì)多種超分辨方法具有潛在的增益，這十幾年間二者深深地聯(lián)系在了一起。

3.1 單物鏡光片顯微鏡的單分子定位超分辨成像

典型的單分子方法如STORM的原理是：利用熒光染料的發(fā)光特性，對(duì)熒光染料以少量隨機(jī)分布的方式激發(fā)，然后對(duì)發(fā)光的熒光染料單個(gè)分子進(jìn)行定位。通過(guò)多次成像，將每個(gè)分子的位置累加起來(lái)，就可以得到分子分布的高分辨圖像。單分子超分辨方法中，熒光信號(hào)是微弱的。圖像的信噪比越高，單分子定位的精度就會(huì)越高。傳統(tǒng)照明方法具有高背景熒光，高信噪比也是光片顯微鏡的優(yōu)勢(shì)之一。一般的單分子顯微鏡只能將成像范圍限制在表面樣品，但與光片顯微鏡結(jié)合后，可以將厚樣本納入研究范圍。

3.2 單物鏡光片顯微鏡的結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像

在上述幾種超分辨成像方法中，SIM超分辨顯微術(shù)具有相對(duì)較快的速度，與光片技術(shù)都常用于活細(xì)胞的成像場(chǎng)景。要想實(shí)現(xiàn)各向同性分辨率增益的結(jié)構(gòu)光顯微成像，則需要在三個(gè)方向上拍攝3張相位相差π/3的圖像，利用9張圖片重建獲得超分辨圖像。但如何在光片顯微鏡中實(shí)現(xiàn)頻率滿(mǎn)足周期性的條紋一直是一個(gè)難點(diǎn)。

圖5 結(jié)合單分子定位方法的單物鏡光片顯微鏡。（a）soSPIM-PLAM成像，左邊寬場(chǎng)，右邊超分辨；（b）soSPIM-dSTORM超分辨成像，左邊寬場(chǎng)，右邊超分辨；（c）組織深度為50μm的代表性體積obSTORM圖像，十張圖像堆疊，深度顏色編碼；（d）obSTORM高傾斜角度的光片入射；（e）光片角度下理論和實(shí)驗(yàn)PSF的對(duì)比。

光片顯微鏡自問(wèn)世以來(lái)，由于其真實(shí)物理意義上的光學(xué)切片以及與各種光學(xué)技術(shù)的適用性迅速流行起來(lái)，并在十多年間發(fā)展突飛猛進(jìn)。單物鏡光片顯微術(shù)作為一種新興的體積成像方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)。單物鏡光片顯微鏡解決了傳統(tǒng)光片顯微鏡不可用載玻片的問(wèn)題，并釋放了幾何空間的限制，同時(shí)解決了正交光片顯微鏡不能使用高NA物鏡的問(wèn)題，聯(lián)合超分辨成像技術(shù)后，光片顯微鏡分辨水平得到進(jìn)一步提升。單物鏡光片顯微鏡推動(dòng)了光片顯微鏡在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，單物鏡光片顯微鏡由于具有快速成像和活細(xì)胞成像的特點(diǎn)，特別適用于對(duì)一些神經(jīng)信號(hào)、血流等高速生命活動(dòng)的觀(guān)察，并且可以用于一些在體成像場(chǎng)景，是一種快速體積成像利器。

當(dāng)然單物鏡光片顯微鏡很多儀器部件都需要特殊定制并且許多部件價(jià)格昂貴，這無(wú)疑增加了單物鏡光片的使用成本，限制了單物鏡光片的推廣，在這一方面還需要研究人員繼續(xù)開(kāi)發(fā)低成本光片顯微鏡。同時(shí)，在光片顯微鏡發(fā)展的過(guò)程中，往往一臺(tái)光片顯微鏡難以滿(mǎn)足多種應(yīng)用場(chǎng)景的需求，一些新型單物鏡光片顯微鏡可以結(jié)合在倒置顯微鏡上，滿(mǎn)足多種尺度成像需求，這有利于光片顯微技術(shù)走進(jìn)更多生命科學(xué)研究人員的實(shí)驗(yàn)室。

拓展知識(shí)——光片顯微鏡優(yōu)勢(shì)

1.1 低光毒性、光漂白性與低光損傷

光毒性(phototoxicity)是指在較長(zhǎng)時(shí)間的強(qiáng)光照射下，生物樣本細(xì)胞內(nèi)的熒光分子會(huì)產(chǎn)生分解現(xiàn)象，這是利用激光作為光源進(jìn)行顯微觀(guān)測(cè)時(shí)無(wú)法避免的。光漂白(photobleaching) 指的是熒光分子在光照下熒光褪色減弱的過(guò)程，幾乎所有的熒光團(tuán)在光照下都會(huì)出現(xiàn)褪色。光損傷(photodamage)是指長(zhǎng)時(shí)間或是高劑量進(jìn)行激光掃描樣品，令樣品細(xì)胞內(nèi)熒光分子受到破壞的現(xiàn)象。光毒性、光漂白和光損傷是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡觀(guān)察樣本常面臨的負(fù)面效應(yīng)。而光片顯微鏡側(cè)向照明的方式使其只需照亮觀(guān)測(cè)平面即可觀(guān)測(cè)所要觀(guān)測(cè)的成像面，使得光毒性和光漂白效應(yīng)降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)，解決了共聚焦顯微鏡成像時(shí)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)觀(guān)測(cè)的問(wèn)題。

1.2 高時(shí)空分辨率

不同于共聚焦顯微鏡采用光電倍增管（PMT）探測(cè)，光片顯微鏡采用了寬視場(chǎng)的圖像采集器：科研級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體相機(jī)(sCMOS)進(jìn)行逐面成像，使得被激發(fā)光所照射的平面所有的熒光信號(hào)都能被檢測(cè)到。光片顯微鏡結(jié)合精確的采樣定位系統(tǒng)便可以快速地獲得樣品多層次的光學(xué)切片，還可在低光毒性的基礎(chǔ)上對(duì)活樣本同時(shí)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的多色、多視角成像。

1.3 支持活體、活細(xì)胞、完整胚胎器官成像

光片顯微鏡采用的正交光路設(shè)計(jì)，使其具有較大的觀(guān)測(cè)空間，可以觀(guān)測(cè)較大的樣本，其樣品可以是較大尺度的哺乳動(dòng)物的完整胚胎、器官等，也可以觀(guān)察如秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)、黑腹果蠅、斑馬魚(yú)和小鼠等模式生物的動(dòng)物活體胚胎；同時(shí)高分辨的光片顯微鏡還可進(jìn)行對(duì)于活細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察。

1.4 拓展性和適用性強(qiáng)，易于改進(jìn)和優(yōu)化

常見(jiàn)光源的光是容易產(chǎn)生衍射和散射問(wèn)題的高斯光束(Gaussianbeam)存在觀(guān)測(cè)視場(chǎng)與軸向分辨率相互制約的問(wèn)題，利用艾里光束(Airy beam)或貝塞爾光束(Bessel beam)等方式來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高斯光束來(lái)產(chǎn)生光片，顯著增強(qiáng)了高散射的大型生物樣品的體內(nèi)細(xì)胞分辨率三維成像的信號(hào)對(duì)比度和成像深度。目前針對(duì)不同的具體研究條件產(chǎn)生了以正交光路設(shè)計(jì)為核心的一系列光片熒光顯微鏡：近紅外二區(qū)光片、多向選擇性層狀光照明顯微鏡(mSPIM)、特殊設(shè)計(jì)的水浸式倒置光片、數(shù)字掃描激光光片顯微鏡(DLSM) 、單分子傾斜平面顯微鏡(obSTORM)等。

通過(guò)PubMed查詢(xún)關(guān)鍵詞“lightsheet”、“selective plane illumination，2021年11月已經(jīng)有1725篇相關(guān)文獻(xiàn)；截至2020年12月，被Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的以“lightsheet fluorescence”或“selective plane illumination”為關(guān)鍵詞的文獻(xiàn)已有超過(guò)2200篇，包括但不限于對(duì)光片熒光顯微鏡的改進(jìn)和應(yīng)用。這表示近年來(lái)光片顯微成像技術(shù)得到了極大的發(fā)展和應(yīng)用；這些創(chuàng)新和改進(jìn)的光片顯微成像技術(shù)，極大豐富了科研人員的生物樣品成像方式，使得我們更加深入了解和感知生物體的生命活動(dòng)規(guī)律。

此外，近年來(lái)國(guó)外內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室都在進(jìn)行光片顯微技術(shù)開(kāi)發(fā)，如利用超構(gòu)表面生成光片和超分辨光片熒光顯微技術(shù)：晶格光片顯微技術(shù)、相干結(jié)構(gòu)照明光片顯微技術(shù)、受激輻射損耗光片顯微技術(shù)、隨機(jī)光學(xué)漲落成像光片顯微技術(shù)等，這些技術(shù)正在積極探索之中，它們的突破有望改變光片熒光顯微系統(tǒng)構(gòu)架并極大拓寬在生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用。

比較幾種超分辨光片顯微技術(shù)：(a)晶格光片;(b)相干結(jié)構(gòu)照明光片;
(c)受激輻射損耗光片;(d)隨機(jī)光學(xué)漲落成像光片

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