光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤點：相差
 

光學(xué)顯微鏡適用于多種檢材，如組織切片、活細胞、電路板等。不同檢材光學(xué)特性差異大，需使用不同觀察方式，主要有明場、相差、熒光、偏光、DIC、暗場、霍夫曼相襯七大方式。

一臺光學(xué)顯微鏡可能擁有一種或多種觀察方式，上期我們介紹了明場，今天來說說相差觀察方式。

1935年荷蘭物理學(xué)家澤尼克（Frits Zernike）發(fā)現(xiàn)相襯原理并應(yīng)用到顯微鏡上，主要用于觀察活細胞等無色透明樣品，此種觀察方式稱為相差觀察、相襯觀察或澤尼克相襯觀察，在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。

（1）成像原理

人眼只能在光波的波長（顏色）和振幅（亮度）有變化的情況下，才能區(qū)分被檢物體。對于和周圍介質(zhì)折射率相差不大的透明狀物體，光線通過物體時波長和振幅變化不顯著，難以分辨。
 

左圖：明場觀察的酵母，對比度差

右圖：相差觀察的酵母，輪廓和細節(jié)清晰
 

培養(yǎng)基與細胞、細胞器與細胞質(zhì)之間都有明確的分界面，當光線通過這些界面時，一部分光直射通過，另一部分攜帶界面圖像信息的光則成為衍射光。直射和衍射光波長一致，因此顏色一致，衍射光的光程（相位）比直射光多1/4個波長，但人眼無法區(qū)分。相差觀察利用光的干涉原理，將這個光程相位差，轉(zhuǎn)換成振幅（亮度）變化，從而提升了分界面的襯度，讓人眼可以區(qū)分。
 

相差原理光路圖
 

兩束波的疊加，上圖為相隔π/2相位的疊加波，疊加后的波形振幅得到加強，表現(xiàn)為變亮；下圖為相隔π相位的疊加波，疊加后的波形振幅被減弱，表現(xiàn)為變暗

 

（2）關(guān)鍵部件

相差觀察需要相差聚光鏡和相差物鏡兩個特殊部件，其效果還會受光源光強影響，因為從明場切換到相襯時會顯著降低成像亮度。

①相差聚光鏡是在光源與聚光鏡之間加入相差環(huán)（環(huán)形光闌annular diaphragm）實現(xiàn)的，作用是使透過聚光鏡的光線形成環(huán)形光。相差環(huán)的環(huán)狀孔（中空環(huán)）直徑和孔寬與物鏡內(nèi)的相位環(huán)板匹配，形成的像恰好落在物鏡后焦面與相位板上的共軛面重合，因此不同倍數(shù)物鏡要與不同倍數(shù)的環(huán)匹配。

相差環(huán)可通過推拉環(huán)板、轉(zhuǎn)盤聚光鏡等形式切換進出光路，倒置顯微鏡通常使用聚光鏡相差環(huán)板推拉實現(xiàn)切換。
 

相差環(huán)板，內(nèi)嵌兩個相差環(huán)和一個明場通道

產(chǎn)品小知識：相差環(huán)附近有對中螺絲，用于對中相差環(huán)，非必要勿擰
 

②相位板（annular phaseplate）：相差物鏡鏡片中有氟化鎂等材料制作的的相位板，是相差效果的核心。按相差物鏡種類可分為正相差和負相差，正相差常見，物鏡標記Ph，背景變暗，樣品邊界外圍形成白色光環(huán)。

負相差比較少見，物鏡標記Nh，背景非常暗，樣品邊界內(nèi)圍形成白色光環(huán)。

帶有相位板的相差物鏡，一般會標注Ph字樣

使用小技巧：相襯物鏡光通過率會降低，一般只適合明場和相差使用。對于iPS細胞和ES細胞等需要使用塑料培養(yǎng)皿的樣品，建議選購明美半復(fù)消色差的相襯物鏡，才能同時滿足相差和熒光觀察。
 

③對中望遠鏡 (centering telescope)：也叫合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，是用于調(diào)中相襯環(huán)的配件，未調(diào)中的相差環(huán)會導(dǎo)致相差效果大打折扣。
 

對中望遠鏡
 

對中望遠鏡調(diào)節(jié)相差環(huán)對中
 

（3）成像特點

相襯觀察成像特征是變暗的背景和樣品邊緣出現(xiàn)較厚的白色光環(huán)，主要用來看活細胞、水生物、薄組織切片之類透明樣品，可以呈現(xiàn)樣品細節(jié)，在厚度5-10μm時效果較好，厚樣品、非透明樣品看起來可能跟明場差不多。
 

（4）主要應(yīng)用

①活細胞培養(yǎng)觀察
 

左圖：貼壁細胞；右圖：懸浮細胞
 

②水生生物（昆蟲、藻類等）觀察
 

用相差顯微鏡觀察車輪蟲，左明場右相差
 

（5）相關(guān)產(chǎn)品
 

①倒置顯微鏡

產(chǎn)品：MI40/MI52-N/MI52-CF/MIX60
 

配置白光LED光源，成像清晰銳利

標配明場和相差觀察方式，使用便捷

可適配不同規(guī)格培養(yǎng)器皿

適用于細胞觀察、水生生物等科研或行業(yè)場景

②活細胞成像儀

產(chǎn)品：MCS11/MCS21/MCS22
 

體積小巧，可放置在培養(yǎng)箱內(nèi)長時間監(jiān)測成像

配置相差環(huán)與相差物鏡，細胞觀測更專業(yè)

可額外配置熒光觀察方式
 

③相差顯微鏡ML31-PH
 

無限遠光學(xué)系統(tǒng)，高品質(zhì)的相差觀察效果

10X/22mm大視野目鏡，觀察舒適視野寬廣

良好的擴展性能，可更換配件實現(xiàn)明場、暗場等觀察

本期的文章就到這里，希望對大家有幫助，下一期我們介紹熒光觀察。

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