脂肪細胞作為重要的能量儲存庫，能有效地將多余的卡路里轉(zhuǎn)化為脂肪，以滿足機體的能量需求。然而，過多的脂肪積累會導(dǎo)致肥胖，這是現(xiàn)代社會中與各種健康問題相關(guān)的一種狀況^[1]。除了在新陳代謝中發(fā)揮作用外，脂肪細胞還通過利用瘦素和脂聯(lián)素等激素影響免疫反應(yīng)和生殖功能^[2]。
脂肪形成的過程，即前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程，在不同物種之間是不同的。此外，體內(nèi)組織和體外細胞中發(fā)生脂肪形成的細胞比例也不同^[3]。研究人員正在積極探索脂肪形成的相關(guān)因素以及這一復(fù)雜過程背后的復(fù)雜調(diào)控機制。  
    由Sylvia P. Poulos發(fā)表的一篇綜述中表明，細胞的分化率隨培養(yǎng)基成分的不同而不同。此外，與脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達水平也隨著時間的推移而變化。因此，評估不同時間點的脂肪形成程度是至關(guān)重要的。使用全自動活細胞成像設(shè)備，如Celloger^® Pro，可以方便地監(jiān)測和測量脂肪生成。  
    以下內(nèi)容便詳細介紹了通過Celloger^® Pro來研究前脂肪細胞系3T3-L脂肪生成的方法。
 
設(shè)備實拍：
    脂肪細胞的分化過程受到多種因素的高度調(diào)控和影響，包括前脂肪細胞的環(huán)境和藥物干預(yù)^{[4、5、6]}。其中，誘導(dǎo)分化時的細胞融合度被認為是影響脂肪細胞形成效率和質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)^[7]。此外，藥物制劑如羅格列酮，一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)的強效激動劑，已被證明在調(diào)節(jié)脂肪形成中發(fā)揮重要作用^{[8、9、10、11、12]}。
    因此，為了評估細胞初始密度如何影響脂肪細胞的分化，我們以四種不同密度播種3T3-L1細胞。此外為了確定羅格列酮對分化過程的影響，將實驗分為兩組，一組是含有羅格列酮的DM，另一組是不含羅格列酮的DM(圖3)。
    本次研究以下圖為實驗流程圖，圖內(nèi)詳細標(biāo)注了各項處理因素以及處理時間點。  

• 確定細胞融合度

    以四種不同密度播種3T3-L1細胞。在接種的第三天，我們使用Celloger^® Pro獲取細胞圖像來驗證融合程度，該功能會在指定日期自動捕獲細胞圖像(圖4a)。然后使用Celloger分析軟件分析這些捕獲的圖像，以確定融合程度(圖4b)。  

• 觀察細胞形態(tài)變化

    在實驗過程中，我們使用配備4X或10X鏡頭的Celloger^® Pro每隔一小時捕獲細胞圖像，驗證脂肪形成過程中的細胞形態(tài)的變化。我們在引入含有羅格列酮的DM II后立即觀察到脂滴形成的時間。細胞主要進化成棕色脂肪樣細胞，有許多微小的脂滴。使用帶有10X鏡頭的Celloger^® Pro，我們可以清楚地識別直徑超過3 μm的脂滴為清晰的水滴狀圖形，無需進一步染色。 該Time-lapse顯示DM II和羅格列酮處理后1小時至36小時每間隔1小時拍攝的圖像 (使用10倍放大，裁剪圖像)
 

• 觀察脂滴形成與脂滴定量

    Oil Red O試劑常用于染色脂滴來評估脂肪細胞的分化水平，但該染色方法在生理條件下是不可行的，很難追蹤隨時間細胞發(fā)生的變化。因此，我們選擇了LipiDyeII，一種適用于活細胞的熒光染料。LipiDyeII不僅可以染色脂滴，還可以在活細胞中進行分析，使過程更加簡單。使用LipiDyeII染色可以觀察到，細胞逐漸形成脂滴，以綠色熒光為特征。同時，熒光信號與明場圖像中觀察到的包膜結(jié)構(gòu)精確吻合(圖6)。即使脂滴在細胞結(jié)構(gòu)中被遮蔽(圖6中箭頭所示)，或者在亮場中太小而無法區(qū)分(圖6中虛線圈所示)，它們也可以很容易地使用熒光識別。  
    我們通過測量熒光覆蓋率來量化分化率，熒光覆蓋率表示脂滴所占的比例(圖7)。由于分化不是均勻地發(fā)生在整個平板上，因此有必要檢查廣泛的區(qū)域進行綜合分析。然而，使用低倍率(如2X)不足以精確測量小脂滴。因此，通過Celloger^® Pro的拼接功能，我們可以在更寬的范圍內(nèi)測量脂滴的比例，獲得更可靠的數(shù)據(jù)。
    圖8顯示了添加或不添加羅格列酮DM II后第13天(圖8a)和整個5天期間(從第8天到第13天)(圖8b)觀察分析到的結(jié)果。羅格列酮顯著提高了脂肪細胞的分化率，熒光區(qū)增強表明脂肪堆積增加。未使用羅格列酮的DM II細胞在120小時后的分化率僅為4.7%。相反，用羅格列酮培養(yǎng)DM II細胞，細胞分化迅速增加，在97小時內(nèi)細胞分化率達到16.6%。但不同濃度的細胞分化程度差異不大。  
結(jié)論：
    脂肪形成是一個復(fù)雜的過程，受多種因子的表達水平調(diào)控。理解這些復(fù)雜的機制需要長時間的細致觀察。傳統(tǒng)方法是，研究人員通過在分化過程中的特定時間點評估特定標(biāo)記物的表達水平。然而，Celloger^® Pro系統(tǒng)能夠?qū)�這些通路進行連續(xù)、長期的監(jiān)測，徹底改變了費時費力的傳統(tǒng)監(jiān)測方法。利用延時成像功能，研究人員可以在不受時間限制的情況下進行長時間的觀測，從而提高實驗效率。Celloger^® Pro的一個顯著特點是其拼接功能，保證既能清晰觀察脂滴的形成又能捕獲大范圍的圖像區(qū)域，以評估整體脂肪細胞分化。此外，通過對脂滴進行熒光染色，并利用Celloger^®的分析軟件測量熒光強度，研究人員可以量化分化程度，為觀察到的變化提供數(shù)值。Celloger^® Pro的應(yīng)用為研究脂肪細胞分化的動態(tài)調(diào)控機制提供了新的研究方法，促進了我們對脂肪形成及其在代謝健康中的關(guān)鍵作用的理解。

參考文獻：
1. Lennarz, William J., and M. Daniel Lane. “ Adipogenesis” Encyclopedia of biological chemistry. Academic Press, 2013. 52-56 
2. Britannica, The Editors of Encyclopaedia. "adipose cell". Encyclopedia Britannica, 18 May. 2020, https://www.britannica.com/science/adipose-cell. Accessed 28 November 2023. 
3. Poulos, Sylvia P ., Michael V . Dodson, and Gary J. Hausman. "Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes." Experimental biology and medicine 235.10 (2010): 1185-1193. 
4. Benchamana, Ameena, et al. "Regulation of adipocyte differentiation and metabolism by lansoprazole." Life sciences 239 (2019): 116897. 
5. Pu, Yong, and Almudena Veiga-Lopez. "PPARγ agonist through the terminal differentiation phase is essential for adipogenic differentiation of fetal ovine preadipocytes." Cellular & Molecular Biology Letters 22 (2017): 1-12. 
6. T eixeira, Catarina, et al. "Enhanced 3T3-L1 differentiation into adipocytes by pioglitazone pharmacological activation of peroxisome proliferator activated receptor-gamma (PPAR-γ)." Biology 11.6 (2022): 806. 
7. Cornelius, Peter, Ormond A. MacDougald, and M. Daniel Lane. "Regulation of adipocyte development." Annual review of nutrition 14.1 (1994): 99-129. 
8. Farmer, S. R. "Regulation of PPARγ activity during adipogenesis." International journal of obesity 29.1 (2005): S13-S16. 
9. Wabitsch, Martin, et al. "Characterization of a human preadipocyte cell strain with high capacity for adipose differentiation." International journal of obesity 25.1 (2001): 8-15. 
10. T ontonoz, Peter, et al. "T erminal differentiation of human liposarcoma cells induced by ligands for peroxisome proliferator-activated receptor γ and the retinoid X receptor." Proceedings of the National Academy of Sciences 94.1 (1997): 237-241. 
11. Zebisch, Katja, et al. "Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes." Analytical biochemistry 425.1 (2012): 88-90. 
12. Zhao, Xueyan, et al. "A comparison of methods for effective differentiation of the frozen-thawed 3T3-L1 cells." Analytical biochemistry 568 (2019): 57-64.