優(yōu)化光合效率是開(kāi)發(fā)更可持續(xù)和高產(chǎn)作物品種的一個(gè)非常有前途的策略。這一方法有可能顯著提高田間作物的農(nóng)藝性狀，已有幾項(xiàng)突破性成果證明了這一點(diǎn)，例如構(gòu)建新的光呼吸支路、提高替代電子傳遞途徑的效率或增加熱耗散NPQ。6月7日，Science Advances在線發(fā)表美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校植物與微生物生物學(xué)系Krishna K. Niyogi課題組題為"Multiplexed CRISPR-Cas9 mutagenesis of rice PSBS1noncoding sequences for transgene-free overexpression"的最新研究論文。報(bào)道了該研究小組通過(guò)CRISPR/Cas9工具編輯植物中自然存在的參與光保護(hù)過(guò)程的基因來(lái)改變光合作用。
 

研究人員通過(guò)對(duì)水稻PSBS1基因上游的非編碼序列進(jìn)行了多重CRISPR-Cas9誘變，借助利用高通量篩選方法分離出了120個(gè)基因編輯的等位基因，基因敲除到過(guò)表達(dá)使得它們?cè)隗w內(nèi)具有不同的非光化學(xué)淬滅(NPQ)能力。過(guò)表達(dá)使OsPsbS1蛋白豐度增加了兩到三倍，與轉(zhuǎn)基因獲得的倍數(shù)變化相當(dāng)。PsbS 蛋白豐度的提高增強(qiáng)了NPQ 能力和水分利用效率。在本研究解決的遺傳變異中，研究人員發(fā)現(xiàn)了5′UTR 插入缺失和倒位在分別驅(qū)動(dòng)基因敲除/敲低和過(guò)表達(dá)表型中的作用。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，如這里產(chǎn)生的252 kb的重復(fù)/倒位，證明了CRISPR-Cas9在促進(jìn)基因組重大變化方面的潛力，而對(duì)轉(zhuǎn)錄組的脫靶擾動(dòng)可以忽略不計(jì)。相關(guān)的研究結(jié)果可為未來(lái)針對(duì)超常等位基因的基因編輯策略提供參考，并推動(dòng)了對(duì)具有加速光保護(hù)弛豫的基因編輯非轉(zhuǎn)基因水稻植物的研究。
 

本研究中，高通量篩選編輯等位基因的大致流程如下，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將針對(duì)PSBS1基因上游特定gRNA位點(diǎn)的CRISPR-Cas9構(gòu)建體引入水稻愈傷組織，生成了覆蓋PSBS1表達(dá)水平范圍（從敲除（KO）到過(guò)表達(dá)（OX））的突變等位基因庫(kù)。使用高通量葉綠素?zé)晒夂Y選評(píng)估不同等位基因的NPQ能力，從78株二倍體T0植株中鑒定出穩(wěn)定、可遺傳的表型。其中葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)量通過(guò)葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)MAXI-IMAING-PAM完成。
 

另外，植物表型與蛋白表達(dá)關(guān)系的研究結(jié)果是鑒定出兩種顯著提高PsbS蛋白豐度和NPQ的等位基因，但OX等位基因的頻率較低（1.67%）。研究發(fā)現(xiàn)，OX等位基因使OsPsbS1蛋白豐度增加了兩到三倍，增強(qiáng)了NPQ能力和iWUE。PsbS豐度和NPQ之間存在對(duì)數(shù)關(guān)系，表明PsbS豐度的微小增加對(duì)NPQ能力的影響很小，這導(dǎo)致在篩選過(guò)程中KO/KD突變的富集。

結(jié)構(gòu)變異和表型效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，5′UTR插入/缺失和倒位在推動(dòng)KO/KD和OX表型中起著重要作用。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異（如252-kb的重復(fù)/倒位）顯著影響基因表達(dá)，而不會(huì)引起主要的脫靶轉(zhuǎn)錄組擾動(dòng)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在重復(fù)/倒位區(qū)域內(nèi)外的差異表達(dá)基因，表明基因調(diào)控的目標(biāo)性和特異性。

氣體交換和紅光依賴的表型研究發(fā)現(xiàn)，PSBS1的過(guò)表達(dá)在非常高的光強(qiáng)下增加了NPQ能力，但也顯示了在中等光強(qiáng)下PsbS蛋白豐度和iWUE之間的強(qiáng)相關(guān)性。這表明除了NPQ之外，其他因素（如類囊體醌的氧化還原狀態(tài)）可能參與了在不同光照條件下調(diào)節(jié)光合作用和氣孔導(dǎo)度。
 

總之，本研究的諸多發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CRISPR-Cas9在通過(guò)靶向基因編輯產(chǎn)生顯著遺傳變異和改善農(nóng)藝性狀方面的潛力。高通量篩選方法有效地鑒定出理想表型，但OX等位基因的低頻率表明隨機(jī)順式調(diào)控元件誘變的挑戰(zhàn)。理解順式調(diào)控機(jī)制并改進(jìn)基因編輯策略，有助于開(kāi)發(fā)具有顯著農(nóng)藝效益的小效應(yīng)等位基因。

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