與傳統(tǒng)的2D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比，3D 細(xì)胞球體提供了更多的仿生微環(huán)境， 在許多組織工程應(yīng)用中已被證明是有價(jià)值的。盡管3D 細(xì)胞培養(yǎng)具有受益效應(yīng)，但目前球體形成方法的可擴(kuò)展性有限，對(duì)球體組織工程的臨床翻譯 提出了挑戰(zhàn)。雖然最近采用的液滴微流體可以提供一個(gè)連續(xù)的生產(chǎn)過(guò)程， 但使用油和表面活性劑，通常低通量，以及額外的生物制造步驟的要求阻 礙了球體培養(yǎng)的臨床翻譯。在這里，使用清潔(例如，無(wú)油和無(wú)表面活性劑) ，超高通量(例如，8.5 mL min-1,10000個(gè)球體 s-1) ，單步空氣微流控  生物制造球體形成區(qū)室化水凝膠。這種新技術(shù)可以可靠地生產(chǎn)一維纖維， 二維平面和三維體積劃分的水凝膠構(gòu)造，其中每一個(gè)都允許空心球形成隔 室的明顯(一)各向同性取向。在噴墨生物打印分區(qū)水凝膠中產(chǎn)生的球體在成軟骨行為方面優(yōu)于2D 細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，細(xì)胞球體可以從劃分的水凝  膠中獲得，并用于以自下而上的方式構(gòu)建形狀穩(wěn)定的厘米大小的無(wú)生物材 料的活組織。因此，預(yù)計(jì)在空氣中微流體生產(chǎn)的球形分區(qū)水凝膠可以促進(jìn) 生產(chǎn)和使用的細(xì)胞球體的各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

1. 引言
2D 體外細(xì)胞培養(yǎng)歷來(lái)是組織工程領(lǐng)域的  黃金標(biāo)準(zhǔn)，其目的是修復(fù)、再生或替換受 損的活組織。然而，傳統(tǒng)的2D 細(xì)胞培養(yǎng)  環(huán)境不像它們?cè)隗w內(nèi)的天然對(duì)應(yīng)物，因此 對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生不利影響。3D 細(xì)胞培養(yǎng)  , 如細(xì)胞球體或類(lèi)器官已經(jīng)允許一種更加 仿生的方法來(lái)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。[6-8]已經(jīng)廣 泛報(bào)道，仿生3D 球體培養(yǎng)的細(xì)胞在用于  組織工程時(shí)優(yōu)于2D 培養(yǎng)的細(xì)胞[9-13] ，并且可以促進(jìn)更可靠的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，并 使得具有改進(jìn)功能的宏觀組織構(gòu)建體的工 程。例如，載有干細(xì)胞球體的生物墨水的 3D 打印改善了生物制品構(gòu)建體的功能行為(例如，成軟骨分化和軟骨基質(zhì)沉積) 。 雖然有希望，但是諸如球體培養(yǎng)等3D培養(yǎng)技術(shù)的生產(chǎn)方法阻礙了它們的臨床翻譯 , 這些生產(chǎn)方法通常是批處理過(guò)程，擁有屬性較低。

這些批量生產(chǎn)技術(shù)如微孔[9,10,12,21-24]和懸掛滴[13,2 5-27]需要多個(gè)復(fù)雜和耗時(shí)的步驟，只能提供有限的球體產(chǎn)量 。盡管特定的生物反應(yīng)器方法可以提高產(chǎn)量，但它們?nèi)匀痪窒抻谂�處理過(guò)程，與微電池和懸掛液滴等隔離技術(shù)相比，這  些批處理過(guò)程通常對(duì)球體直徑的控制水平較低。 [28]雖然這  可能足以進(jìn)行小型實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，但仍然需要具有高生  產(chǎn)率和高單分散性的強(qiáng)大的單步生物制造技術(shù)來(lái)促進(jìn)臨床尺  寸組織的球體技術(shù)的臨床翻譯。 [29,30]微流體防火分區(qū)最近被研究用于將球體生產(chǎn)從批量生產(chǎn)過(guò) 程發(fā)展為連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程。在中空生物材料隔室中的細(xì)胞微流  體封裝允許細(xì)胞球形成微生物反應(yīng)器的控制連續(xù)生產(chǎn)，這提供了比傳統(tǒng)的批處理工藝更高的生產(chǎn)率。 [31-3提供了比傳統(tǒng)的批處理工藝更高的生產(chǎn)率。 [31-39]

然而，由于各種原因，傳統(tǒng)的片上微流控液滴發(fā)生器的設(shè)計(jì)阻礙了微流控液滴產(chǎn)生的球體在臨床上的廣泛應(yīng)用。首先，傳統(tǒng)的芯片上微流體需要使用不可混溶的液體來(lái)形成液滴，這通常需要使用已知具有潛在危害并且常常與臨床應(yīng)用不相容的油和表面活性劑。因此，產(chǎn)生的球體形成隔室需要大量清洗， 以試圖在培養(yǎng)/使用之前除去油和表面活性劑，這與耗時(shí)的手工過(guò)程有關(guān)，這對(duì)細(xì)胞活力有不利影響。[45,46]其次，雖然傳統(tǒng)的芯片上微流體允許連續(xù)的球體生產(chǎn)，但液滴形成通常僅限于滴 水狀態(tài)，導(dǎo)致低吞吐量(< 10μLmin-1)  ，這對(duì)于大多數(shù)臨床應(yīng)用仍然不足。最后，從它們的隔室中回收球體以進(jìn)行進(jìn)一步的生物制造加工通常需要一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，這可能對(duì)細(xì)胞 存活產(chǎn)生不利影響。因此，仍然需要一種清潔、快速、細(xì)胞友好和單步生物制造策略，使大型工程組織具有原位球化形成特性。

在這里，我們介紹了一種新的空氣微流體(IAMF)[48]為基礎(chǔ)的生物打印技術(shù)，克服了球體使用的翻譯限制。具體來(lái)說(shuō)， IAMF實(shí)現(xiàn)了包含無(wú)生物材料細(xì)胞的隔室的生物物質(zhì)工程，這些隔室起到了球體形成微反應(yīng)器的作用。有利的是，這種創(chuàng)新方法代表了用于以臨床相關(guān)速率(1-8.5 mL min-1相當(dāng)于10000  個(gè)球體 s-1)產(chǎn)生高密度細(xì)胞球體的臨床尺寸水凝膠的工程的單 步生物制造技術(shù)。生產(chǎn)能力的顯著提高是由于 IAMF 能夠單分 散地賦予噴墨生物印刷油墨在噴射狀態(tài)下具有中空隔室，而傳 統(tǒng)的芯片上方法僅限于更慢的滴水狀態(tài)。這種新型的生物制造 過(guò)程也是非常清潔的，因?yàn)?IAMF 消除了傳統(tǒng)上對(duì)油，表面活性劑或犧牲模板的需要，以在工程組織內(nèi)創(chuàng)建空心隔室。除了傳統(tǒng)的基于機(jī)器的噴墨生物打印之外，我們證明我們的內(nèi)聯(lián)自下而上的生物制造也可以以簡(jiǎn)單的手持設(shè)備的形式使用， 以手動(dòng)打印具有多種復(fù)雜性的球體形成的分隔水凝膠，這進(jìn)一步促進(jìn)了該技術(shù)與臨床應(yīng)用的兼容性。雖然微型組織的大規(guī)模生產(chǎn) 的翻譯挑戰(zhàn)對(duì)于過(guò)多的不同組織類(lèi)型是重要的[28] ，但我們產(chǎn)生了臨床大小的軟骨組織作為模型組織，同時(shí)承認(rèn)使用這種 方法也可以產(chǎn)生廣泛的其他(器官)形狀。

2. 結(jié)果和討論
2.1. 空氣微流體技術(shù)在分區(qū)水凝膠生物制備中的應(yīng)用
IAMF 是一種微流體方法，通過(guò)在空氣中將液體射流與由壓電驅(qū)動(dòng)的液體射流產(chǎn)生的恒定周期的水滴流碰撞，使得能夠以超高吞吐量產(chǎn)生無(wú)芯片、無(wú)油和細(xì)胞相容的單分散微粒。 [48]

在這項(xiàng)研究中，我們將 IAMF與噴墨生物打印相結(jié)合， 以允許空氣中形成的中空微膠囊的控制合并，從而能夠生產(chǎn)大規(guī)模的區(qū)室化水凝膠。為此，將兩個(gè)微噴嘴設(shè)置與可移動(dòng)的 XYZ收集工作臺(tái)結(jié)合使用(圖1a)。

為了形成中空微膠囊，含有氯化鈣(CaCl 2)的核心微噴溶液  與通過(guò)使用壓電驅(qū)動(dòng)將振動(dòng)疊加到微噴嘴上而產(chǎn)生的受控液滴 系統(tǒng)相撞(圖1b)。具有降低表面張力(jcore  > jalgate)的海藻酸  鹽前體微噴的 Dropjet 聚結(jié)允許 Marangoni 驅(qū)動(dòng)的封裝(圖1c)  。這種封裝過(guò)程發(fā)生在 je something (iμD4/阝j2)1/3的時(shí)間尺度上，i，D ，μ 和 j 分別表示微噴密度，直徑，粘度和表面張 力，通常在幾毫秒內(nèi)。這使得在收集液滴之前的10-100毫秒的  液滴飛行時(shí)間內(nèi)可以完全封裝。這使得能夠生產(chǎn)含有 CaCl2 核心和海藻酸鹽前體外殼的雙層液滴。由此產(chǎn)生的核殼(即海藻   酸鈣)化合物液滴通過(guò)從核心層向海藻酸鹽層擴(kuò)散的 CaCl2  以?xún)?nèi)向外的方式交聯(lián)(圖1d)。由于離子海藻酸鹽交聯(lián)發(fā)生在毫秒范圍內(nèi)[50]  ，并且由于交聯(lián)的內(nèi)向外性質(zhì)，當(dāng)復(fù)合液滴仍然在空 氣中時(shí)， 內(nèi)部海藻酸鹽層交聯(lián)，而外部海藻酸鹽層通過(guò)Ca2  +  離子的內(nèi)向擴(kuò)散隨時(shí)間發(fā)生交聯(lián)。然后通過(guò)可移動(dòng)的XYZ 收集器或微噴臺(tái)以控制的方式收集部分交聯(lián)的微膠囊。

值得注意的是，撞擊的時(shí)刻是定時(shí)的，使得空氣形成的微囊的交聯(lián)仍然在進(jìn)行中，使得它們?cè)谥�陸時(shí)立即與微囊進(jìn)行物理接觸，從而有效地形成包含空心微隔室的瞬時(shí)固體3D構(gòu)建體(圖1e)。

我們假設(shè)通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的基于液滴的生物制造方法調(diào)整微膠囊放置，可以以強(qiáng)大的，可預(yù)測(cè)的和可控的方式形成1D纖維，2D 平面和3D體積的分區(qū)水凝膠(圖1f)。使用手持生物打印裝置(圖1g，h)證明了這種生物制造方法，其允許使用形狀穩(wěn)定的區(qū)室化水凝膠手動(dòng)直接填充缺陷(圖1i-k)。該手持方法預(yù)計(jì)將促進(jìn)臨床應(yīng)用，如在外科手術(shù)過(guò)程中的原位生物打印。 此外，我們證明了這種新型的生物制造方法也可以與可編程3D生物打印機(jī)(圖11，m)相結(jié)合，我們證明了允許生產(chǎn)由更復(fù)雜 的幾何形狀組成的大規(guī)模結(jié)構(gòu)，如形狀穩(wěn)定的管狀分區(qū)水凝膠 (圖1n，o 和電影 S1，支持信息)。IAMF 的超高通量性質(zhì)(高達(dá)8.5 mL min-1)(圖 S1，支持信息)允許以快速，直接和單步 方式生物制造臨床尺寸的分區(qū)水凝膠(圖1p，q)。

由于 IAMF 產(chǎn)生的液滴的超高吞吐量和短的空中飛行時(shí)間，通常需要快速(毫秒)交聯(lián)策略，如所提出的海藻酸鹽離子交聯(lián)或光聚合。然而，依賴(lài)于較慢(幾秒鐘)交聯(lián)機(jī)制的材料，如絲素蛋白，仍然可以利用海藻酸鈉作為犧牲結(jié)構(gòu)互穿網(wǎng)絡(luò)模板。