自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀不僅適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞與原代細(xì)胞,也適用于酵母、藻類和原生動(dòng)物等尺寸較小的細(xì)胞。與手動(dòng)計(jì)數(shù)相比,自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的優(yōu)勢(shì)包括:
- 使細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化,提高計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性
- 提升計(jì)數(shù)速度,從而提高統(tǒng)計(jì)精度與通量。例如,屢獲殊榮的EVE™ Plus細(xì)胞計(jì)數(shù)儀能夠在1秒內(nèi)得到明場(chǎng)下的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀還有許多其他優(yōu)點(diǎn),如易于操作的界面:可以評(píng)估細(xì)胞形狀與測(cè)量細(xì)胞大小,來(lái)確認(rèn)細(xì)胞類型特征。
2. 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
在本章節(jié)將會(huì)講述自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的三種方法以及各自的優(yōu)缺點(diǎn)。
(1)電阻抗計(jì)數(shù)法
電阻抗是利用庫(kù)爾特原理對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。首先需要將細(xì)胞懸浮在弱電解質(zhì)溶液中,然后將該溶液通過(guò)直徑精確的小孔,通過(guò)施加小電壓,從而形成一個(gè)“感應(yīng)區(qū)”,當(dāng)每個(gè)細(xì)胞通過(guò)孔道時(shí),都會(huì)置換出與自身體積相等的電解質(zhì)溶液,這種置換將產(chǎn)生電壓脈沖,該電壓脈沖代表細(xì)胞數(shù)量,可對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè);較大的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更大振幅的脈沖,因此脈沖高度與細(xì)胞大小成正比。所以樣品中細(xì)胞濃度是通過(guò)精確控制和測(cè)量通過(guò)孔的液體體積來(lái)確定的。
與光學(xué)計(jì)數(shù)相比,庫(kù)爾特計(jì)數(shù)法不受細(xì)胞顏色或折射率的影響,能夠計(jì)數(shù)樣品中存在的所有顆粒。如Beckman Coulter的Multisizer 4e細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,能精確計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)量以及大小。電阻抗計(jì)數(shù)法的優(yōu)勢(shì)在于,與手工計(jì)數(shù)相比,該方法提升了計(jì)數(shù)的精確度與速度,但它不能進(jìn)行活細(xì)胞/死細(xì)胞的分析,無(wú)法得出細(xì)胞存活率,且不能精確計(jì)數(shù)成團(tuán)的細(xì)胞。
(2)基于圖像的細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞成像技術(shù)的進(jìn)步使得基于圖像的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀迅速發(fā)展。這些系統(tǒng)使用與手動(dòng)計(jì)數(shù)相同的原理,但通常操作更為簡(jiǎn)便,并可以提供細(xì)胞形狀和大小的信息。操作流程是將樣本加入一次性計(jì)數(shù)板的腔室,調(diào)整預(yù)設(shè)的參數(shù)并進(jìn)行計(jì)數(shù)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)是通過(guò)無(wú)標(biāo)記分析、細(xì)胞染色或熒光測(cè)量實(shí)現(xiàn)的,光學(xué)模式有明場(chǎng)、單色熒光或雙色熒光。這些自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以測(cè)量各種細(xì)胞類型和細(xì)胞密度,并且通常具有一系列附加功能,包括參數(shù)設(shè)置、細(xì)胞閥門大小、自動(dòng)聚焦以及數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和記錄。他們主要是對(duì)單視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù),但近期研發(fā)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以拍攝多張視野圖像進(jìn)行計(jì)數(shù),以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的精度。
基于圖像的細(xì)胞計(jì)數(shù)有眾多優(yōu)勢(shì):
- 通量?jī)?yōu)勢(shì)
- 易于操作的界面
- 運(yùn)營(yíng)成本低
- 大大減少計(jì)數(shù)錯(cuò)誤
- 降低用戶之間的差異性
但基于圖像的細(xì)胞計(jì)數(shù)卻難以計(jì)數(shù)低濃度的細(xì)胞。
(3)流式細(xì)胞術(shù)
雖然流式細(xì)胞術(shù)提供了對(duì)細(xì)胞特性的快速定量,但在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)需要先確定細(xì)胞濃度,或者使用額外的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。因此,復(fù)雜性和高成本可能會(huì)對(duì)小型實(shí)驗(yàn)室造成障礙。
然而,該技術(shù)可以在異質(zhì)混合細(xì)胞群中有效地分選細(xì)胞,所以可以用于計(jì)數(shù)原代細(xì)胞。使用特定體積的已知濃度的熒光微珠,將其添加到一個(gè)特定的樣品體積來(lái)創(chuàng)建一個(gè)已知的比例,然后通過(guò)測(cè)量被記錄的熒光微珠的數(shù)量來(lái)?yè)Q算樣品的體積,從而得到細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。
基于圖像的流式細(xì)胞術(shù),可以在一個(gè)系統(tǒng)中定義多個(gè)參數(shù),是一種非常強(qiáng)大的細(xì)胞表征和分析工具,但同時(shí)也代表著昂貴的費(fèi)用以及繁瑣且專業(yè)的操作,現(xiàn)今的實(shí)驗(yàn)室很少單純地將流式細(xì)胞術(shù)用于細(xì)胞計(jì)數(shù),往往會(huì)用流式去做定性或定量分析細(xì)胞功能與分選細(xì)胞。
三、計(jì)數(shù)儀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
市面上的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀多種多樣,大家對(duì)各品牌的計(jì)數(shù)儀也褒貶不一,那么我們?cè)撊绾慰陀^地評(píng)價(jià)一款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀呢?這就需要參考細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
儀器行業(yè)的發(fā)展推動(dòng)了各種細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的發(fā)展,并廣泛地應(yīng)用于總細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類細(xì)胞計(jì)數(shù)。在缺乏參考資料的情況下,測(cè)量方法的準(zhǔn)確性很難確定。同時(shí)生物制劑的復(fù)雜性(如細(xì)胞類型、來(lái)源、制備等)也使這一問(wèn)題更加突出。因此在沒(méi)有參照材料或參照方法的情況下,需要制定措施來(lái)保證細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程中的質(zhì)量。
本文提供了一種通過(guò)稀釋系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析得出的一組質(zhì)量指標(biāo)來(lái)評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。該方法適用于總細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、直接細(xì)胞計(jì)數(shù)和間接細(xì)胞計(jì)數(shù),前提是測(cè)量過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)(例如,將細(xì)胞應(yīng)為懸浮狀態(tài)),且該方法主要適用于真核細(xì)胞。
在細(xì)胞計(jì)數(shù)中獲得高置信度意味著測(cè)量既準(zhǔn)確又精確。具體來(lái)說(shuō),通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析,可以評(píng)估描述偏離比例和變異系數(shù)(CV)的質(zhì)量指標(biāo),以評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程的質(zhì)量。質(zhì)量指標(biāo)評(píng)估細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程的整體質(zhì)量,其中測(cè)量過(guò)程包括樣品制備和處理、數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)處理/校正。
1. 樣品制備
- 測(cè)試材料應(yīng)為懸浮細(xì)胞,且細(xì)胞應(yīng)為單細(xì)胞、細(xì)胞聚集體或細(xì)胞團(tuán)聚體。
- 用于為細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程生成代表性測(cè)試樣本的制備和處理程序應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,以保持測(cè)試樣本的特性。
- 樣品制備程序應(yīng)避免對(duì)細(xì)胞造成損傷,防止改變其計(jì)數(shù)能力,并避免引入/減少可干擾或人為改善細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量過(guò)程的碎片。
2. 稀釋分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
使用一個(gè)細(xì)胞懸液作為母液,在預(yù)期濃度范圍內(nèi)稀釋為不同濃度的可重復(fù)代表性測(cè)試樣本,如果濃度和組成完全相同,則可以使用額外的細(xì)胞原液。
注:該圖描述了從單一細(xì)胞懸液開始的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),其中通過(guò)獨(dú)立稀釋得到一組包含3個(gè)重復(fù)代表性樣本(n=3)的稀釋分?jǐn)?shù),對(duì)每個(gè)代表性樣本進(jìn)行三次重復(fù)計(jì)數(shù)。
i表示細(xì)胞原液不同稀釋分?jǐn)?shù)的數(shù)量(i=1,.....,i);dfi表示不同的稀釋分?jǐn)?shù),值在0至1之間;ni表示為目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)的具有代表性的重復(fù)測(cè)試樣本數(shù);kij表示第i個(gè)稀釋分?jǐn)?shù)的第j樣本的重復(fù)測(cè)量次數(shù);Yijk表示來(lái)自細(xì)胞原液的第i個(gè)目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)的第j個(gè)重復(fù)代表性樣本的第k個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)樣本的值。
統(tǒng)計(jì)方法:
在該細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)中,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過(guò)程如下圖:
由該圖可得需計(jì)算四項(xiàng)指標(biāo):
①細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值(Ydfi)
細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值(Ydfi)表示目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)df的一組測(cè)試樣本的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值。
其中Yij表示df的第j個(gè)代表性測(cè)試樣本的k個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)值的平均值,由以下公式得出:
②變異系數(shù)(CV)
變異系數(shù)(CV)是衡量各觀測(cè)值變異程度的統(tǒng)計(jì)量。樣本測(cè)量精度應(yīng)使用重復(fù)性測(cè)量值的變異系數(shù)(CV)進(jìn)行評(píng)估,用百分比(%CV)表示。CV值越小,表示數(shù)據(jù)越穩(wěn)定,變異程度越小,反之則表示數(shù)據(jù)不穩(wěn)定,變異程度較大。CVij表示具有目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)df的代表性測(cè)試樣品j的重復(fù)性觀測(cè)數(shù)值的變異系數(shù)。
%CVdfi表示具有目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)df的一組n個(gè)代表性測(cè)試樣品的變異系數(shù)平均百分比。
③決定系數(shù)(R2)
決定系數(shù)R2是在數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)領(lǐng)域廣泛使用的指標(biāo),用于描述模型與一組觀測(cè)值的擬合程度。
其中,Y......是一組 n 個(gè)具有代表性的獨(dú)立測(cè)試樣本 j 的 Yij 的平均值;一組目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù) (DF) 的重復(fù)代表性測(cè)試樣本的 Yij 的平均值由公式給出:
④比例指數(shù)(PI)
用戶應(yīng)根據(jù)平滑殘差計(jì)算比例指數(shù)(PI)。
用戶應(yīng)根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量的預(yù)期用途選擇PI的計(jì)算方法。
3. 結(jié)果報(bào)告
細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)以細(xì)胞濃度表示,單位為細(xì)胞/ml,報(bào)告應(yīng)包含以下質(zhì)量指標(biāo):
四、NanoEnTek細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
目前,市面上有各種各樣的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,因?yàn)榛趫D像的細(xì)胞計(jì)數(shù)原理與手動(dòng)計(jì)數(shù)原理相同,所以大部分成像儀均是利用成像對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。目前被廣泛應(yīng)用的計(jì)數(shù)儀品牌如下表所示:
NanoEnTek 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列曾在Select Science網(wǎng)站上獲得世界質(zhì)量認(rèn)證銀獎(jiǎng),該系列產(chǎn)品收獲了7200 多條評(píng)論和 4.8 分的星級(jí)評(píng)價(jià)(滿分5分);并且一次性血細(xì)胞計(jì)數(shù)板系列也獲得了質(zhì)量認(rèn)證白金獎(jiǎng)?wù)隆?/span>
蘇州奎克泰生物為韓國(guó)NanoEnTek中國(guó)區(qū)總授權(quán)?颂┥飸{借極佳的生命科學(xué)設(shè)備產(chǎn)品和優(yōu)質(zhì)的服務(wù),斬獲“2024年度創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室設(shè)備提供商”獎(jiǎng),充分體現(xiàn)了我司的生命科學(xué)(細(xì)胞)設(shè)備類產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)服務(wù)和行業(yè)影響力等多方面的實(shí)力獲得了肯定。
我司代理的計(jì)數(shù)儀系列中,EVE™細(xì)胞計(jì)數(shù)儀簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,能對(duì)成團(tuán)細(xì)胞精準(zhǔn)計(jì)數(shù)、計(jì)算細(xì)胞活率,選擇細(xì)胞大小范圍;EVE™ Plus最快1秒出結(jié)果;EVE™ HT / HT FL高通量計(jì)數(shù)儀3min內(nèi)可一次性計(jì)48 個(gè)樣本。ADAM™ CellT是一款cGMP生產(chǎn)環(huán)境下可用的自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及ADAMII™ LS是一款基于熒光強(qiáng)度的桌面圖像型流式細(xì)胞分析儀,能夠提供多功能實(shí)驗(yàn)和高準(zhǔn)確度結(jié)果(與流式細(xì)胞儀結(jié)果一致),穩(wěn)定性高。多款設(shè)備符合21 CFR Part 11要求,可在cGMP環(huán)境下使用,深受客戶贊譽(yù)。
并且,我司的計(jì)數(shù)儀系列在準(zhǔn)確度與精確度方面有著良好的優(yōu)勢(shì),相信會(huì)有一款細(xì)胞計(jì)數(shù)儀能滿足您的需求。
1. EVE系列
EVE™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
準(zhǔn)確性:分別使用EVE與手工計(jì)數(shù)的方法對(duì)同一種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)試,結(jié)果證明EVE的計(jì)數(shù)結(jié)果與手工計(jì)數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)高度相關(guān)性,且測(cè)量范圍優(yōu)于手工計(jì)數(shù)。
穩(wěn)定性:分別使用EVE、手工計(jì)數(shù)板、競(jìng)品對(duì)HepG2、MCF7、F9進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)樣本重復(fù)7次,結(jié)果證明EVE自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀與競(jìng)品相比,與手工計(jì)數(shù)結(jié)果更接近,且有更好的精確性。
EVE™ PLUS 超快速自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀
準(zhǔn)確性:分別使用EVE PLUS與手工計(jì)數(shù)的方法對(duì)同一種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)試,結(jié)果證明EVE PLUS的計(jì)數(shù)結(jié)果與手工計(jì)數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)高度相關(guān)性,且測(cè)量范圍優(yōu)于手工計(jì)數(shù)。