--細 胞 基 本 信 息---
細胞名稱： HSF(SV40)(人包皮成纖維細胞)
細胞別稱： HSF-SV40
細胞貨號： SNL-500
生長特性： 貼壁
培養(yǎng)條件： 成纖維細胞培養(yǎng)體系
培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃
細胞簡介： HSF(SV40)細胞是取自8歲男童包皮真皮組織的成纖維細胞通過SV40轉化而獲得的永生化細胞，合適條件下至少可以穩(wěn)定傳代20代以上。
 
細胞正常生長形態(tài)照片
 
HSF(SV40)細胞培養(yǎng)注意事項：
 
1. 細胞貼壁較弱
該細胞貼壁比較弱，因此在遇到運輸低溫及震蕩、室溫靜置太長時間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷等情況時會出現(xiàn)明顯的細胞回縮變粗變短的現(xiàn)象，及時放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)后可恢復正常。
 
2. 對消化非常敏感
該細胞在消化時極易受損，需要非常精細的控制消化操作、消化時間及吹打力度。若控制不好，會導致細胞形態(tài)異常、生長速度減慢甚至無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)，很容易出現(xiàn)傳代一兩次就無法繼續(xù)生長傳代的情況。（詳細傳代步驟見下文）
 

• 對培養(yǎng)基要求高

該細胞需使用成纖維細胞專用培養(yǎng)體系培養(yǎng)，否則可能出現(xiàn)細胞死亡或無法生長情況。
 

• 注意控制細胞密度

細胞密度過高時及時傳代，避免培養(yǎng)基變黃太快或細胞高密度培養(yǎng)導致細胞脫落或者狀態(tài)變差。早期代數的細胞生長較快，注意及時換液及傳代；細胞傳代容易成團聚集，注意控制消化時間不能太短，接種時盡量吹散為單顆細胞。
 

• 原代永生細胞

該細胞由原代包皮成纖維細胞通過SV40轉化而獲得，傳代次數有限，建議盡早完成實驗。
 
HSF(SV40)細胞傳代攻略

• 準備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預熱）
• 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
• T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
• 消化到細胞明顯回縮，間隙變大，但未完全脫落時加2-3mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；

Tips：

• 如果您無法準確掌控胰酶作用時間，建議按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫，PBS潤洗細胞后，將胰酶加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒拿出觀察一次，可用手掌輕拍1-2下培養(yǎng)瓶側邊，如果部分細胞開始自然滑落，說明細胞消化完成，加完全培養(yǎng)基終止消化，否則再等30秒重復操作直至細胞能夠自然滑落；細胞貼壁較弱，所以消化時間會比常規(guī)貼壁細胞短很多，注意控制消化時間；

• 混勻細胞并轉移至離心管中，1000rpm離心3min；
• 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）
• 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣。

Tips：

• 推薦傳代比例1：2，細胞生長至80%密度時即可傳代。
• 建議傳代后24h再觀察細胞，若有漂浮死細胞，可通過換液去除
• 控制吹打力度輕柔，吹打次數不能過多（每次重懸吹打不超過10次）

 
HSF(SV40)細胞凍存攻略

• 配制程序性凍存液，準備相應數量凍存管并做好標記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO

• 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；
• 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；
• 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
• 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips：

• 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。
• 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產品說明書處理降溫過程。
• T25培養(yǎng)瓶長滿通�？蓛龃�2-3管，10cm皿長滿通�？蓛龃�3-4管。
• 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

 
 
HSF(SV40)細胞復蘇方法

• 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；
• 將細胞從液氮罐中取出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
• 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導致受傷。
• 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。  
• 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會有差異
• 離心完成后棄上清，用預熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
• 復蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

Tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。
 
HSF(SV40)細胞收貨攻略

• 常溫細胞

• 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
• 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細胞較多，應離心收集懸浮細胞并放回原瓶

• 凍存細胞

• 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
• 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；
• 復蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

• 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
• 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；

 
常見問題及解決方案

NO.1細胞密度怎么計算的？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；
 
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經驗為準。 
 
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