封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA試劑盒其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的目的是避免高背景和非特異性條帶。

封閉的原理：

1、固相載體表面(如elisa板，NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞，通過電轉或包被，膠上的蛋白被轉移到了膜上，或抗原/抗體固定在板上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。

2、蛋白塞進了表面的很多孔洞里面，但蛋白并不是連續(xù)的，有很多空隙，而且比如說樣品孔之間也有空隙，這些孔洞并沒有填進東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。

3、封閉液中的蛋白可以與表面上的空白空洞位置結合，同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異結合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結合在空白位置上。這4、樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。

封閉劑應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。

在免疫學實驗中，通常使用封閉劑來減少非特異性結合。常用的封閉劑有脫脂奶粉，BSA，血清以及 Fab 片段單鏈二抗等。根據(jù)不同的平臺選擇相應的封閉劑。

1、脫脂奶粉

作用原理：脫脂奶粉含有多種蛋白，可以封閉未吸附蛋白的固相載體（WB 膜、ELISA 板等）位點，減少抗體與之結合的概率，避免非特異性結合帶來的高背景。

優(yōu)點：價格便宜，因含多種不同分子量的蛋白，故封閉起來更全面。

缺點：成分復雜，適用范圍窄。不適用于生物素和堿性磷酸酶標記的抗體系統(tǒng)。且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的生產中較少應用。

2、牛血清白蛋白BSA

作用原理：同脫脂奶粉，封閉未吸附蛋白的固相載體位點。

優(yōu)點：成分單一，適用于 ELISA 實驗，生物素、堿性磷酸酶系統(tǒng)的免疫學檢測實驗或者其他對特異性要求較高的實驗。

缺點：大部分 BSA 中有少量的抗體殘留，會導致抗原/抗體之間的交叉反應，造成一定背景。

3、動物血清

作用原理：

1、待檢樣本會有些與蛋白非特異性結合的物質，從而導致背景過高，因此可以用血清封閉掉這部分非特異性的結合，從這點看，血清和 BSA 沒有明顯區(qū)別；

2、待檢樣本中可能會有 Fc 受體，可以和抗體恒定區(qū)結合，而封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本 Fc 受體之間結合。BSA 則無法封閉 Fc 受體。

優(yōu)點：因為血清可以封閉 Fc 受體及減少抗體間的非特異性結合，故在免疫組化、免疫熒光實驗中有廣泛應用。

缺點：某些封閉血清中可能含有疊氮鈉，因此不適用于 HRP 酶標的檢測體系。

4、Fab 片段單鏈二抗

作用原理：由于二價的抗體（全 IgG 或 F（ab’）2 片段）有兩個結合位點，不能用來封閉。而 Fab 片段單鏈二抗只有一個結合位點，因此可完全封閉免疫球蛋白。

應用：在 IHC 或 IF 雙標/多標實驗中，封閉樣本表面的免疫球蛋白，封閉組織切片或細胞表面的內源性免疫球蛋白，并可解決兩個一抗來自同一種屬的麻煩。

5、無蛋白封閉劑---新型高效封閉劑

Blocker 無蛋白封閉劑，該封閉劑是通過化學合成高親水性化合物，不存在生物封閉劑所擔心的生物安全性、質量、批間差等問題。

主要特點：

1）與微球表面活化的羧基偶聯(lián)形成穩(wěn)定的共價鍵
2）純化學合成，批間差小，純度高
3）空間結構簡單，更充分的封閉微球表面，降低微球非特異性吸附，減少基質干擾
4）提高試劑靈敏度
5）含大量親水基團，有利于提高試劑穩(wěn)定性

應用領域：乳膠免疫比濁試劑/ 化學發(fā)光試劑 ，代替 BSA 作為封閉劑或與 BSA 聯(lián)合封閉。

6、免疫試劑穩(wěn)定液

免疫試劑穩(wěn)定液主要用于免疫分析檢測試劑/抗原/抗體/蛋白的保存.  該產品屬于即用型，無需稀釋，使用簡單方便，將待保存物質溶于穩(wěn)定液中后置于冰箱即可。免疫試劑穩(wěn)定   液有利于維持蛋白的三維結構，保持蛋白的生物活性，可延長免疫分析試劑及蛋白的使用期限，確保產品的性能。

應用領域:

1）免疫分析試劑保存, 如免疫比濁檢測試劑/化學發(fā)光檢測試劑
2）蛋白質保存，如抗原/抗體/酶類等