菌種復(fù)蘇傳代與保存方法分述
菌株概念及傳代：
- 標(biāo)準(zhǔn)菌株：直接從官方菌種保藏機構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認(rèn)為第0代菌株。
- 標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實驗室轉(zhuǎn)接一代后得到的一套完全相同的獨立菌株。通常為第1代或第2代菌株。
- 儲備菌株：從標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的培養(yǎng)物。通常為第2代或第3代菌株。
- 工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株、 儲備菌株或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（經(jīng)證明或未經(jīng)證明） 轉(zhuǎn)接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。傳代：每一次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)都是一次傳代的過程，可以使用液體、固體或半固體培養(yǎng)基。
注意事項：菌株傳代只能由上往下傳，儲備菌株可以做為工作菌株使用，但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實驗室使用的工作菌株一般不可超過第5代。常用培養(yǎng)基種類：斜面培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基。接種方法：涂布法、劃線法、穿刺法、直接加入法等。
菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
一、菌種的復(fù)蘇
把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入超凈工作臺或生物安全柜。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。
取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。
二、菌種的傳代與保存
1：菌斜面（保存）
培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。
至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。
點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉(zhuǎn)種一次。
2：菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。
常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷*銨瓊脂培養(yǎng)基；金黃se葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。
三、菌懸液的制備
取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。
四、對照用菌液制備
取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50 ~ 100個。用平板計數(shù)。此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內(nèi)使用。
五、菌種保管
菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應(yīng)及時更換。購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報告。
菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
一、菌種的復(fù)蘇
把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入超凈工作臺或生物安全柜。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。
取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。
取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進(jìn)行平板分離單菌落。
二、菌種的傳代與保存
1：菌斜面（保存）
培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。
至冰箱取出的菌種斜面，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。
點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。
堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉(zhuǎn)種一次。
2：菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。
常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷*銨瓊脂培養(yǎng)基；金黃se葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。
三、菌懸液的制備
取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。
四、對照用菌液制備
取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50 ~ 100個。用平板計數(shù)。此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內(nèi)使用。
五、菌種保管
菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應(yīng)及時更換。購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報告。
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