--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： J774A.1(小鼠單核巨噬細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： J-774A.1; J774.A1; J774 A1; J774A.1; J 774A.1; J774 A.1
細(xì)胞貨號(hào)： SNL-333
生長(zhǎng)特性： 半貼壁細(xì)胞
培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO₂)，5%；37℃
細(xì)胞簡(jiǎn)介： J774A.1細(xì)胞是1968年從患有網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的成年雌性 BALB/cN小鼠腹水中分離的。J774A.1細(xì)胞有抗體依賴的吞噬作用，生長(zhǎng)受硫酸葡聚糖、PPD和LPS的抑制。J774A.1細(xì)胞可產(chǎn)生IL-1β和大量的溶菌酶。
     
J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
 

• 細(xì)胞半貼壁圓形或多角形生長(zhǎng)，部分懸浮圓形，傳代時(shí)均可收集培養(yǎng)，換液時(shí)將懸浮細(xì)胞離心收集后重新接回原瓶，若貼壁細(xì)胞較多活性較好時(shí)可以不要懸浮的細(xì)胞。

 

• J774A.1細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感，接觸胰酶后將發(fā)生自發(fā)分化，貼壁變緊，很難消化下來(lái)。所以不建議用胰酶對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行傳代。（詳細(xì)傳代步驟見下文）

 

• J774A.1細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，消耗營(yíng)養(yǎng)也較快。建議每天觀察細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%時(shí)及時(shí)進(jìn)行傳代，以防細(xì)胞過度生長(zhǎng)狀態(tài)變差。密切關(guān)注培養(yǎng)基顏色，當(dāng)培養(yǎng)基有變黃趨勢(shì)時(shí)及時(shí)換液，以防營(yíng)養(yǎng)不夠?qū)е录?xì)胞狀態(tài)變差。

 
J774A.1細(xì)胞傳代方法

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無(wú)菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）

2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清，留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面吹下細(xì)胞；
2. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，900rpm 離心 3-5min，棄上清；
3. 加新的完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里；
4. 補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
Tips：

• 吹打次數(shù)不宜過多，吹打力度保持輕柔，以免機(jī)械刺激造成細(xì)胞自分化或損傷。
• 推薦使用1mL吸頭進(jìn)行吹打

 
J774A.1細(xì)胞凍存方法

• 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO

• 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀；
• 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；
• 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
• 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips：

• 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長(zhǎng)期保存。
• 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
• T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通�？蓛龃�2-3管，10cm皿長(zhǎng)滿通�？蓛龃�3-4管。
• 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

 
J774A.1細(xì)胞復(fù)蘇方法

• 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
• 將細(xì)胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
• 凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù)，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
• 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。  
• 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異
• 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
• 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
 
J774A.1細(xì)胞收貨攻略
 

• 常溫細(xì)胞

• 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
• 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時(shí)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多，應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

• 凍存細(xì)胞

• 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；
• 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
• 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

• 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；
• 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

 
常見問題及解決方案
NO.1細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？
嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。
 
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
 
產(chǎn)品推薦：
【SNL-333】J774A.1 (小鼠單核巨噬細(xì)胞)
【SNLM-333】J774A.1細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基