腫瘤樣本中癌細(xì)胞總是混合一定未知比例的正常細(xì)胞，我們稱腫瘤樣本中癌細(xì)胞所占的比例為腫瘤純度（Tumor purity），稱由染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常導(dǎo)致的腫瘤樣本中癌細(xì)胞的真正含量為倍性（Tumor ploidy）。估計(jì)腫瘤的純度和倍性有利于癌癥基因組進(jìn)化和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性研究。

Sequenza是一個(gè)使用配對(duì)的腫瘤/正常樣本DNA測(cè)序數(shù)據(jù)來估計(jì)腫瘤樣本純度和倍性的軟件，同時(shí)還檢測(cè)腫瘤樣本拷貝數(shù)變異。本期小編詳細(xì)給大家介紹該軟件的安裝及使用。

1 軟件安裝   

首先是軟件安裝，該軟件依賴python包sequenza-utils和R包sequenza，分別安裝這兩個(gè)包，有很多小伙伴在安裝軟件的過程中總會(huì)遇到各種版本問題，建議使用conda虛擬環(huán)境安裝，首先在虛擬環(huán)境中安裝python和R：

# 創(chuàng)建虛擬環(huán)境Sequenza，并安裝python

conda create -n Sequenza python=3.8

# 為虛擬環(huán)境安裝R

conda install -n Sequenza r=3.6.3

# 進(jìn)入虛擬環(huán)境Sequenza

conda activate Sequenza

然后就是在虛擬環(huán)境中進(jìn)行python和R包安裝，跟在linux環(huán)境下安裝一樣。

1.1.sequenza-utils安裝（python包）

sequenza-utils包安裝比較容易，以下有兩種安裝方式：

官方說明：https://sequenza-utils.readthedocs.io/en/latest/

# 安裝方法1（推薦）

pip install sequenza-utils

# 安裝方法2

git clone https://bitbucket.org/sequenza_tools/sequenza-utils

cd sequenza-utils

python setup.py test

python setup.py install

# 安裝成功后，查看幫助

sequenza-utils -h

1.2.sequenza安裝（R包）

# 安裝sequenza包前，需要先安裝copynumber包

install.packages("BiocManager")

library(BiocManager)

BiocManager::install("copynumber")

# 或者使用conda安裝（推薦）

conda install -c bioconda bioconductor-copynumber

# 安裝sequenza包

install.packages("sequenza")

# 安裝成功后，查看幫助

library(sequenza)

library(help="sequenza")

2 使用方法   

Python和R包安裝成功后，就可以進(jìn)行腫瘤純度和倍性評(píng)估，我們使用處理后的腫瘤配對(duì)樣本BAM文件、參考基因組ref文件作為輸入，BAM文件通過基因組比對(duì)流程得到（如GATK標(biāo)準(zhǔn)流程），參考基因組文件可以通過UCSC下載（hg19/hg38）。

2.1. 基于python的預(yù)處理sequenza-utils

# 制作參考基因組GC標(biāo)準(zhǔn)化文件，通過-w參數(shù)分割基因組文件，設(shè)置越小檢測(cè)敏感性越高。

sequenza-utils gc_wiggle -f $ref -w 50 -o - | gzip > hg19.gc50Base.txt.gz

# 根據(jù)腫瘤樣本和對(duì)照樣本BAM文件統(tǒng)計(jì)GC標(biāo)準(zhǔn)文件每個(gè)堿基的深度和等位堿基頻率等。

sequenza-utils bam2seqz \

-gc $out/hg19.gc50Base.txt.gz \

-F $ref \

-n $normalbam \

-t $tumorbam | gzip >$out/$tumor/${tumor}.seqz.gz \

# 提取測(cè)序深度，確定正常標(biāo)本中的純合和雜合位置，并從腫瘤標(biāo)本中計(jì)算出變異等位基因和等位基因頻率。減小seqz文件的大小，提高模型運(yùn)行效率

sequenza-utils seqz_binning -w 50 \

-s $out/$tumor/${tumor}.seqz.gz | gzip >$out/$tumor/${tumor}_small.seqz.gz

2.2. 模型擬合及可視化工具sequenza

# 輸入文件（${tumor}_small.seqz.gz）預(yù)處理

（1）需要?jiǎng)h除chrM或非常規(guī)染色體數(shù)據(jù)，否則會(huì)報(bào)錯(cuò)xlim有非限制值；

（2）為了提高評(píng)估準(zhǔn)確性，可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，比如篩選DP > 10。

       這個(gè)處理步驟自行使用python或R編程，然后再壓縮，名字還是一樣。

# 導(dǎo)入預(yù)處理數(shù)據(jù)，并對(duì)腫瘤進(jìn)行GC含量歸一化與正常深度之比，并使用“copynumber”軟件包進(jìn)行等位基因特異性分割。

test <- sequenza.extract(“${tumor}_small.seqz.gz”, verbose = FALSE)

# 推斷細(xì)胞性和倍性參數(shù)以及拷貝數(shù)分布圖，使用后驗(yàn)概率空間的局部最大值來提供替代解決方案

CP <- sequenza.fit(test)  

#計(jì)算純度和倍性，很耗時(shí)間

# 返回估計(jì)結(jié)果以及替代解決方案以及沿基因組和單個(gè)染色體的數(shù)據(jù)和模型的可視化

sequenza.results(sequenza.extract = test,

cp.table = CP,

sample.id = sample,

out.dir=sample)

3 結(jié)果說明

所有的結(jié)果文件說明如下：

結(jié)果有很多，但是純度和倍性的相關(guān)結(jié)果其實(shí)就3個(gè)文件，如下：

我們依次打開這三個(gè)文件，一起來看看結(jié)果長(zhǎng)啥樣：

（1）result_alternative_solutions.txt

表1 腫瘤樣本純度和倍性評(píng)估結(jié)果

 

說明：Cellularity：腫瘤樣本純度 Ploidy：腫瘤樣本倍性 SLPP：對(duì)數(shù)后驗(yàn)概率

（2）result_CP_contours.pdf

圖1 腫瘤樣本純度與模型結(jié)果

說明：橫坐標(biāo)為倍性值，縱坐標(biāo)為純度值，背景藍(lán)色表示最有可能的分布，白色表示最不可能的分布，其中紅色圈點(diǎn)為最優(yōu)值，即SLPP值最大，其它為次優(yōu)解（圖中“+”）

（3）result_model_fit.pdf

圖2 腫瘤樣本倍性模型評(píng)估結(jié)果

說明：橫坐標(biāo)為B allele frequency，縱坐標(biāo)左側(cè)Depth ratio代表每個(gè)基因組片段腫瘤樣本與正常樣本測(cè)序深度比（低比值下估算的腫瘤樣本拷貝數(shù)不可信），縱坐標(biāo)右側(cè)copy number代表模型估算的拷貝數(shù)（黑色圓圈和點(diǎn)），背景顏色越紅表示越可信。

好了，以上就是使用基因組數(shù)據(jù)評(píng)估腫瘤樣本純度和倍性的過程。更多實(shí)用生信分析方法，小編將持續(xù)更新。