熒光顯微鏡應(yīng)用于病毒學(xué)研究

瀏覽次數(shù)：825　發(fā)布日期：2024-4-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、病毒

病毒是一種個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡單，只含一種核酸（DNA或RNA），需要在活細(xì)胞內(nèi)寄生并以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型生物。病毒是一種非細(xì)胞生命形態(tài)，它由一個(gè)核酸長鏈和蛋白質(zhì)外殼構(gòu)成，病毒沒有自己的代謝機(jī)構(gòu)，沒有酶系統(tǒng)。因此病毒離開了宿主細(xì)胞，就成了沒有任何生命活動(dòng)、也不能獨(dú)立自我繁殖的化學(xué)物質(zhì)。它的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的能力都是在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，當(dāng)它進(jìn)入宿主細(xì)胞后，它就可以利用細(xì)胞中的物質(zhì)和能量完成生命活動(dòng)，按照它自己的核酸所包含的遺傳信息產(chǎn)生和它一樣的新一代病毒。

流感病毒渲染圖

二、光學(xué)顯微鏡在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

相比于常見細(xì)胞的幾十微米級(jí)別尺寸，病毒的尺寸小很多，一般在60-220nm，而受制于可見光的衍射峰值，光學(xué)顯微鏡無法分辨200nm以下的物體，因此無法對(duì)病毒進(jìn)行結(jié)構(gòu)尺度的觀測(cè)，目前應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對(duì)病毒進(jìn)行觀測(cè)研究主要是從以下兩個(gè)方面著手：

（1）通過觀測(cè)對(duì)病毒進(jìn)行特異性標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒位置數(shù)量的判斷。病毒主要由核酸和蛋白質(zhì)組成，常見的一種方法是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與病毒含有的靶DNA分子或RNA分子進(jìn)行雜交，可通過在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，來確定與特異探針雜交后被染色的病毒的分布和數(shù)量，這種方式也稱為原位熒光雜交技術(shù)（FISH）。

FISH做的病毒檢測(cè)，紅色為病毒外殼蛋白
（引自公開論文https://doi.org/10.1073/pnas.1820132117）

（2）通過檢測(cè)病毒入侵導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的免疫物質(zhì)或病理形態(tài)變化，從而判斷病毒種類、分布和數(shù)量。正常細(xì)胞在面對(duì)病毒入侵時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的免疫物質(zhì)就可作為熒光染料標(biāo)記的結(jié)合物，通過熒光顯微鏡對(duì)免疫熒光信號(hào)進(jìn)行觀測(cè)從而做出檢測(cè)判斷，這種通過對(duì)免疫蛋白進(jìn)行標(biāo)記的方式也稱之為免疫熒光（IF），這種方式在臨床上常見的應(yīng)用有呼吸道七聯(lián)檢或九聯(lián)檢。

呼吸道七聯(lián)檢免疫熒光，MF31拍攝（綠色為病毒反應(yīng)）

應(yīng)用類似原理，還有不使用熒光染色的免疫組化(IHC)染色，主要用于尸檢研究，判斷病毒對(duì)身體各器官的感染情況，比如新冠病毒和猴痘病毒都能找到相關(guān)研究。

IHC免疫組化染色，猴痘病毒感染犬的支氣管（紅色為病毒反應(yīng)）

病毒入侵也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞或組織發(fā)生病理變化，如感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞的胞漿膜發(fā)生融合，形成多核的巨細(xì)胞，或某些病毒感染細(xì)胞時(shí)，在光學(xué)明場(chǎng)顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸或嗜堿性染色、大小不同和數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，如HPV人乳頭狀瘤病毒。

HPV引起，分化不良的鱗狀細(xì)胞癌

三、顯微成像技術(shù)在病毒觀測(cè)中的挑戰(zhàn)

根據(jù)上述光學(xué)顯微鏡對(duì)病毒的檢測(cè)方式，主要有兩種方式，一是使用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光染料標(biāo)記病毒本身的熒光信號(hào)或入侵細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體物質(zhì)熒光信號(hào)，二是使用明場(chǎng)方式觀測(cè)IHC或者HE染色的細(xì)胞或組織的病理形態(tài)。

主要的挑戰(zhàn)來自病毒本身體積小，含量相對(duì)較低，導(dǎo)致熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)弱，需要使用較強(qiáng)的激發(fā)光與高靈敏度的顯微相機(jī)進(jìn)行成像；使用免疫熒光方式檢測(cè)病毒對(duì)特異性染料的選擇及熒光顯微鏡濾光片的選擇要求較高，需要保證病毒標(biāo)志物熒光信號(hào)不被其它種類的熒光信號(hào)所覆蓋，對(duì)通道的選擇及熒光圖像軟件的合成有很高的要求。