通過生物打印液滴和環(huán)形結構體開發(fā)膠原蛋白收縮試驗的過程與結果
摘要
在過去的幾十年里，膠原凝膠收縮實驗被廣泛用于研究 生物力學過程、組織修復機制和3D疾病模型。收縮試驗 的典型程序包括人工將膠原蛋白澆鑄入孔中，聚合和分 離。3D生物打印為許多基于收縮的分析和細胞培養(yǎng)模型 的自動化提供了一條途徑，因為它允許自動分配膠原蛋 白，精確的體積和圖案控制，直接在加熱的打印上進行熱聚合，并通過自動釋放板涂層剝離凝膠。
在這項研究中，使用BIO ONE生物打印嵌入人真pi成纖維細胞的膠原液滴和膠原環(huán)，并在有血清和不含血清 的生長培養(yǎng)基中監(jiān)測48和72小時。結果表明，生物打印的膠原蛋白結構具有較高的細胞活力，隨著細胞濃度和血清水平的增加，收縮率隨時間的推移而增加。這表明，3D 生物打印在簡單和復雜的生物力學分析中都具有加速自動化的潛力。
概述
膠原凝膠收縮(CGC) 試驗zui早出現在四十年前 (Bell ,1979年),在了解不同的生物力學過程中發(fā)揮了重要 作用。CGC 試驗利用了細胞填充的3D膠原水凝膠隨時間發(fā)生的可預測和一致收縮的優(yōu)勢Ngo,2006 年 ) 。
組織收縮是發(fā)生在各種組織重塑和疾病途徑中的重要活動 (Al-Kofahi,2015;Dickman,2019;
Matsumoto,2007)。 例如，淋巴系統(tǒng)參與動態(tài)的強 直性和階段性收縮，以維持體內平衡。在重現機械組織 功能、研究新療法和疾病通路時，該技術可替代結構不合適的2D細胞培養(yǎng)和不可持續(xù)的動物模型(Al-Kofahi,2015)。
一般來說，3D細胞培養(yǎng)能更好地支持細胞與細胞之間的 相互作用，與2D細胞培養(yǎng)相比，3D細胞培養(yǎng)能在細胞形 態(tài)、連接蛋白、氧合作用以及藥物和營養(yǎng)吸收方面表現出更多相關的生理差異（Murphy,2014;Pampaloni,2007;Edmondson,2014) 。膠原凝膠為在3D環(huán)境 中研究機械生物學創(chuàng)造了理想的微環(huán)境，因為膠原凝膠 會根據細胞可溶性因子的釋放情況改變收縮率，從而為疾病的進展提供線索(Zhang,2019) 。
然 而 ，CGC分析工作流程仍存在一些問題，如需要大量細胞(Redden,2003年)和過度消耗昂貴的膠原蛋白(96孔板中每個重復>100μL)(Gullberg,1990年 ；Timpson,2011年)。相比之下，3D生物打印技術可在 膠原蛋白用量較少的情況下對敏感細胞類型進行經濟可 行的生物力學篩選，甚至在膠原蛋白形態(tài)復雜的情況下對強健細胞類型進行生物力學篩選(Nerger,2019年）
在過去的幾十年里，膠原凝膠收縮實驗被廣泛用于研究 生物力學過程、組織修復機制和3D疾病模型。收縮試驗 的典型程序包括人工將膠原蛋白澆鑄入孔中，聚合和分 離。3D生物打印為許多基于收縮的分析和細胞培養(yǎng)模型 的自動化提供了一條途徑，因為它允許自動分配膠原蛋 白，精確的體積和圖案控制，直接在加熱的打印上進行熱聚合，并通過自動釋放板涂層剝離凝膠。
在這項研究中，使用BIO ONE生物打印嵌入人真pi成纖維細胞的膠原液滴和膠原環(huán)，并在有血清和不含血清 的生長培養(yǎng)基中監(jiān)測48和72小時。結果表明，生物打印的膠原蛋白結構具有較高的細胞活力，隨著細胞濃度和血清水平的增加，收縮率隨時間的推移而增加。這表明，3D 生物打印在簡單和復雜的生物力學分析中都具有加速自動化的潛力。
概述
膠原凝膠收縮(CGC) 試驗zui早出現在四十年前 (Bell ,1979年),在了解不同的生物力學過程中發(fā)揮了重要 作用。CGC 試驗利用了細胞填充的3D膠原水凝膠隨時間發(fā)生的可預測和一致收縮的優(yōu)勢Ngo,2006 年 ) 。
組織收縮是發(fā)生在各種組織重塑和疾病途徑中的重要活動 (Al-Kofahi,2015;Dickman,2019;
Matsumoto,2007)。 例如，淋巴系統(tǒng)參與動態(tài)的強 直性和階段性收縮，以維持體內平衡。在重現機械組織 功能、研究新療法和疾病通路時，該技術可替代結構不合適的2D細胞培養(yǎng)和不可持續(xù)的動物模型(Al-Kofahi,2015)。
一般來說，3D細胞培養(yǎng)能更好地支持細胞與細胞之間的 相互作用，與2D細胞培養(yǎng)相比，3D細胞培養(yǎng)能在細胞形 態(tài)、連接蛋白、氧合作用以及藥物和營養(yǎng)吸收方面表現出更多相關的生理差異（Murphy,2014;Pampaloni,2007;Edmondson,2014) 。膠原凝膠為在3D環(huán)境 中研究機械生物學創(chuàng)造了理想的微環(huán)境，因為膠原凝膠 會根據細胞可溶性因子的釋放情況改變收縮率，從而為疾病的進展提供線索(Zhang,2019) 。
然 而 ，CGC分析工作流程仍存在一些問題，如需要大量細胞(Redden,2003年)和過度消耗昂貴的膠原蛋白(96孔板中每個重復>100μL)(Gullberg,1990年 ；Timpson,2011年)。相比之下，3D生物打印技術可在 膠原蛋白用量較少的情況下對敏感細胞類型進行經濟可 行的生物力學篩選，甚至在膠原蛋白形態(tài)復雜的情況下對強健細胞類型進行生物力學篩選(Nerger,2019年）
材料和方法
細胞制備
新生兒人真pi成纖維細胞(ndfs) 購 自PromoCell, 并按 照供應商的方案進行培養(yǎng)。NHDFs 在無血清(SF) 成纖維 細胞生長培養(yǎng)基中生長，冷凍前加入補充混合物(PromoCell,Ref #C-23010)和1%青霉素鏈霉素(Gibco,Ref#15070-063)。
在打印之前，將細胞解凍 并混合在生物墨水中而不膨脹。打印后， 一半的樣品在 添加10%胎牛血清(FBS) 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco,Cat #16000044)。
生物墨水制備和生物打印液滴： Coll1(CELLINK,Ref #IKD119261001) 根據 CELLINK 的協議制備用于生物打印。 Coll1 與0,40,000 或400,000 個細胞在培養(yǎng)基中混合，最終膠原蛋白濃度為 2 mg/ mL。 將混合物裝入冷卻的 3 ml 注射器 (BD,Ref#309658) ,加蓋27gnozzle (CELLINK,Ref#NZ4270005001) , 并置于冷卻的打印頭中，溫度為 4°C ，用于液滴打印。 使用BIO ONE(CELLINK， #CL-BP-ONE-G1)上的液滴打印功能，在未經處理的48孔板(VWR, Ref #7342780)上以23µL
液滴的形式打印生物墨水，擠出速度鄭OμL/s, 縮回體 積為7μL。打印完成后，將Coll 液滴在37℃培養(yǎng)箱中熱交聯60分鐘，每孔加入100μL培養(yǎng)基。6小時后，使用抹刀將液滴從井底分離，并獲取圖像。
環(huán)形： 兩個12孔板(VWR,Ref #7342778) 按照制造商的說明涂有 Sigmacote(Sigma-Aldrich,Ref #SL2),以促進膠原環(huán)脫落。將 CELLINK Pluronics 40%(CELLINK,Ref #IKS40000O503) 裝入冷卻的3ml 注射器中，用25G 噴嘴(CELLINK,Ref #NZ4250005001) 蓋上，并置于冷卻的打印頭中，溫度為2℃。使用墨水在兩個涂層孔板上打印犧牲環(huán)屏障 ,設置為：37°℃打印床，5mm/s 打印速度，23μL預流量 ,1.3μL 擠出速度，25μL 收縮體積，0 mm z偏移，10μ L額外預流量，100%填充擠出倍率，60μL/s 收縮速度 ,10μL額外收縮，O s后流停止時間和2 mm z提升。用 于打印環(huán)的膠原蛋白是高質量的1型大鼠尾端膠原蛋白。 將膠原蛋白中和后與100萬個細胞混合，或不與細胞混 合作為對照，使膠原蛋白最終濃度為3mg /mL。將混合物裝入冷卻的3ml 注射器中，注射器上蓋有25G噴嘴，在人工屏障內分配45μL。請參見圖2中的STL文件說明 和完成的打印。將打印物加熱至37℃,使膠原蛋白熱凝 膠5分鐘。 凝膠化后，將板置于冰上1分鐘，使Pluronics冷卻，加入1mL 冷卻培養(yǎng)基。不能自動分離的 環(huán)用抹刀小心地從井底分離出來。Pluronics溶解后，取 出培養(yǎng)基，加入新的熱培養(yǎng)基。將兩個板置于加濕培養(yǎng)箱中，并在72小時內的四個時間點獲取圖像。
圖像分析
生物打印膠原蛋白結構的圖像是用手機(三星galaxy 9, 1200萬像素)拍攝的液滴，用三腳架上的數碼單反相機(尼康，1620萬像素)拍攝的環(huán)。對于液滴，使用圖像處
圖 2: A) 使用Pluronics(黃色)和膠原蛋白(紅色)進行多材料打印的STL模型，B)是打印結構的圖像。
3: FBS增加了小體積生物打印膠原液滴和膠原環(huán)的NHDF收縮性。代表性照片為(A) 40萬個細胞與FBS孵育6小時(B) 48小時后NHDF/膠原凝膠滴。圖(C)顯示了在無血清(SF)或添加FBS的培養(yǎng)基中，膠原蛋白滴滴在48小時后與6小時相比的收縮百分比，分別為0,40,000和400,000 ndfs / mL (ns=無統(tǒng)計學意義;* * P < 0.01;* * * P < 0.001)。 (D) 0小時和(E) 72小時時的環(huán)狀直徑收縮圖像，細胞在FBS條件培養(yǎng)基中。圖(F)顯示了在無血清(SF)或添加FBS的培養(yǎng)基中，在100萬個nffs /mL膠原蛋白和無細胞作為對照的情況下，與0小時相比，24、48和72小時膠原內徑收縮的百分比(ns=無顯著性;* * * * P < 0.0001)。白色弓形嵌入圖像顯示環(huán)(D,E)的增強視圖，比例尺= 200µm
圖 4: 3D生物打印膠原（A）液滴在無血清培養(yǎng)基和（B）FBS 補充培養(yǎng)基中 48 小時后的 NHDF 細胞骨架分支，以及（C）在無血清培養(yǎng)基和（D）FBS 補充培養(yǎng)基中 72 小時后的環(huán)。縮放條 = 200 µm。綠色 = 活細胞，紅色 = 死細胞。
理程序ImageJ(n=5) 測量直徑，以井底直徑為參考。分別在孵育6小時和48小時后捕獲液滴凝膠圖像。 48小 時后測量凝膠表面直徑，直徑變化量為凝膠直徑除以6小 時后測量的初始凝膠表面直徑。對于環(huán)，使用image7 測 量內部空間的面積，并從中提取直徑(SF n=7,FBS n=5, control n=5)。在孵育0、24、48和72小時后捕獲環(huán)的圖像，卷曲的環(huán)從研究中省略。72h后，直徑變化為凝膠直徑除以打印后直接測得的初始凝膠直徑。 根據CELLINK 的Calcein AMandPI活性染色方案，使用Calcein AM(Invitrogen eBioscience,Ref #15560597)和碘化丙啶(Sigma-Aldrich,Ref #81845-25MG)染色來評估48和72小時后的細胞活力。使用熒光顯微鏡(Olympus IX73)使用綠色(FITC) 和紅色(XRED) 通道獲取圖像。采用ImageJ 評估細胞活力。采用非配對t 檢驗(Prism 8,GraphPad Software)評估各組數據之間的差異。
結果和討論
FBS 調理增加了生物3D 打印膠原液滴和膠原環(huán)的收縮百 分比。在含FBS 的培養(yǎng)基中孵育后，可以觀察到液滴和 環(huán)內徑明顯減小(圖3 A-b,D-E)。 當比較SF 培養(yǎng)基中的 凝膠直徑和添加FBS 的凝膠直徑時，可以觀察到液滴和 環(huán)的顯著差異(圖3 C,F)。 這可以歸因于成纖維細胞在 FBS 存在下的增殖特性。此外，在膠原凝膠中培養(yǎng)的成 纖維細胞傾向于獲得雙極紡錘體結構和多分支形態(tài)，這 有助于強直性收縮(Mochitate,1991) 。 通常，當在膠原 凝膠中生長時，成纖維細胞產生的膠原蛋白減少，而蛋 白酶和纖維連接蛋白水平增加。因此，諸如細胞數量增加、肌動蛋白絲束和表面纖維連接蛋白增加等指標也可 歸因于凝膠收縮(Mochitate,1991)。鈣黃素 AM 和碘化丙烯染色的細胞活力顯示，在 FBS 的存在下，細胞的雙極分支模式更加明顯(圖4)。此外， FBS 的存在也與 4 8 和 7 2 小時后更高的細胞活力相關，所有條件下的細胞活力都超過 95%。
這一結果是意料之中的，因為FBS是一種成熟的細胞生 長補充劑。在缺乏FBS 的膠原凝膠中也觀察到超過75% 的活細胞存活率，這進一步支持了生物打印在非理想生 長補充中的應用�？偟膩碚f，生成的數據支持將3D 生物 打印用于簡單的小體積自動收縮分析，并顯示出在更復雜的途徑識別分析中使用的潛力。
未來的研究可能會結合1.DOT給藥和CELLCYTE XW顯微鏡 的收縮跟蹤，以實現完全優(yōu)化的自動化工作流程。此外 ,其他特征或模式可以集成到打印協議中，例如打印傳 感器或柱子，以誘導機械應變并通過收縮環(huán)進行傳感。
結論
經過驗證， BIO ONE 是一種適用于中高通量、低容量、高細胞活力生物力學試驗的有用工具。膠原液滴和膠原環(huán)的收縮率與細胞密度和FBS 調節(jié)有關。
通過3D 生物打印，可以調整分配的體積，以最佳地利用有價值的細胞和材料。BIO ONE打印頭的冷卻功能允許自動和精確地分配 細胞膠原蛋白。在這項研究中，與傳統(tǒng)的鑄造全孔板的方法相比，膠原蛋白液滴的消耗減少了800%以上。打印PLURONICS 支持屏障允許更復雜的膠原蛋白圖案，并可以產生各種形狀。
參考文獻
1. Bell,E.,Ivarsson,B.,and Merrill,C.Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by
human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1979;76(3):1274-1278. DOl:10.1073/pnas.76.3.1274.
2. Al-Kofahi,M.,Becker,F,Gavins,F.N.,et al.IL-1 reduces tonic contraction of mesenteric lymphatic muscle cells, with the involvement of cycloxygenase-2 and prostaglandin E2.British Journal of Pharmacology.2015;172(16): 4038-4051. DOl:10.1111/bph.13194.
3. Dickman,C.T.D.,Russo,V.,Thain,K.,et al.Functional characterization of 3D contractile smooth muscle tissues generated using a unique microfluidic 3D bioprinting technology.The FASEB Journal.2019;34:1652-1664. DOI: 10.1096/fj.201901063RR.
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5. Ngo,P.,Ramalingam,P.,Phillips,J.A.,Furuta,G.T.Collagen gel contraction assay.Cell-Cell Interactions.2006; 341:103-109. DOl:10.1385/1-59745-113-4:103.
6. Zhang,T,Day,J.H.,Su,X.,et al.Investigating fibroblast-induced collagen gel contraction using a dynamic
microscale platform.Frontiers in Bioengineering and Biotechnology.2019;7:196. DOl:10.3389/fbioe.2019.00196.
7. Murphy,S.V.,and Atala,A.3D bioprinting of tissues and organs.Nature Biotechnology.2014;32(8):773-785.DOI: 10.1038/nbt.2958.
8. Pampaloni,F.,Reynaud,E.G.,and Stelzer,E.H.The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.Nature Reviews:Molecular Cell Biology.2007;8(10):839-845. DOl:10.1038/nrm2236.
9. Edmondson,R.,Broglie,J.J.,Adcock,A.F.,et al.Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.Assay and Drug Development Technologies.2014;12(4):207-218.DOI: 10.1089/adt.2014.573.
10.Redden,R.A.,and Doolin,E.J.Collagen crosslinking and cell density have distinct effects on fibroblast-mediated contraction of collagen gels.Skin Research and Technology.2003;9:290-293.DOl:10.1034/j.1600- 0846 2003 00023 x
11.Gullberg,D.,Tingstrom,A.,Thuresson,A.C.,et al.b1 integrin-mediated collagen gel contraction is stimulated by PDGF.Experimental Cell Research.1990;186:264-272. DOI:10.1016/0014-4827(90)90305-t .
12.Timpson,P.,McGhee,E.J.,Erami,Z.,et al.Organotypic collagen l assay:A malleable platform to assess cell behavior in a 3-dimensional context.Journal of Visualized Experiments.2011;56:e3089. DOI:10.3791/3089 .
13.Nerger,B.A.,Brun,P.T.,Nelson,C.M.Microextrusion printing cell-laden networks of type I collagen with patterned fiber alignment and geometry.Soft Matter.2019;15:5728-5738.DOl:10.1039/C8SMO2605J .
14.Mochitate,K.,Pawelek,P.,and Grinnell,F.Stress relaxation of contracted collagen gels:Disruption of actin filament bundles,release of cell surface fibronectin,and down regulation of DNA and protein synthesis.
Experimental Cell Research.1991;193:198-207.DO:10.1016/0014-4827(91)90556-a .
理程序ImageJ(n=5) 測量直徑，以井底直徑為參考。分別在孵育6小時和48小時后捕獲液滴凝膠圖像。 48小 時后測量凝膠表面直徑，直徑變化量為凝膠直徑除以6小 時后測量的初始凝膠表面直徑。對于環(huán)，使用image7 測 量內部空間的面積，并從中提取直徑(SF n=7,FBS n=5, control n=5)。在孵育0、24、48和72小時后捕獲環(huán)的圖像，卷曲的環(huán)從研究中省略。72h后，直徑變化為凝膠直徑除以打印后直接測得的初始凝膠直徑。 根據CELLINK 的Calcein AMandPI活性染色方案，使用Calcein AM(Invitrogen eBioscience,Ref #15560597)和碘化丙啶(Sigma-Aldrich,Ref #81845-25MG)染色來評估48和72小時后的細胞活力。使用熒光顯微鏡(Olympus IX73)使用綠色(FITC) 和紅色(XRED) 通道獲取圖像。采用ImageJ 評估細胞活力。采用非配對t 檢驗(Prism 8,GraphPad Software)評估各組數據之間的差異。
結果和討論
FBS 調理增加了生物3D 打印膠原液滴和膠原環(huán)的收縮百 分比。在含FBS 的培養(yǎng)基中孵育后，可以觀察到液滴和 環(huán)內徑明顯減小(圖3 A-b,D-E)。 當比較SF 培養(yǎng)基中的 凝膠直徑和添加FBS 的凝膠直徑時，可以觀察到液滴和 環(huán)的顯著差異(圖3 C,F)。 這可以歸因于成纖維細胞在 FBS 存在下的增殖特性。此外，在膠原凝膠中培養(yǎng)的成 纖維細胞傾向于獲得雙極紡錘體結構和多分支形態(tài)，這 有助于強直性收縮(Mochitate,1991) 。 通常，當在膠原 凝膠中生長時，成纖維細胞產生的膠原蛋白減少，而蛋 白酶和纖維連接蛋白水平增加。因此，諸如細胞數量增加、肌動蛋白絲束和表面纖維連接蛋白增加等指標也可 歸因于凝膠收縮(Mochitate,1991)。鈣黃素 AM 和碘化丙烯染色的細胞活力顯示，在 FBS 的存在下，細胞的雙極分支模式更加明顯(圖4)。此外， FBS 的存在也與 4 8 和 7 2 小時后更高的細胞活力相關，所有條件下的細胞活力都超過 95%。
這一結果是意料之中的，因為FBS是一種成熟的細胞生 長補充劑。在缺乏FBS 的膠原凝膠中也觀察到超過75% 的活細胞存活率，這進一步支持了生物打印在非理想生 長補充中的應用�？偟膩碚f，生成的數據支持將3D 生物 打印用于簡單的小體積自動收縮分析，并顯示出在更復雜的途徑識別分析中使用的潛力。
未來的研究可能會結合1.DOT給藥和CELLCYTE XW顯微鏡 的收縮跟蹤，以實現完全優(yōu)化的自動化工作流程。此外 ,其他特征或模式可以集成到打印協議中，例如打印傳 感器或柱子，以誘導機械應變并通過收縮環(huán)進行傳感。
結論
經過驗證， BIO ONE 是一種適用于中高通量、低容量、高細胞活力生物力學試驗的有用工具。膠原液滴和膠原環(huán)的收縮率與細胞密度和FBS 調節(jié)有關。
通過3D 生物打印，可以調整分配的體積，以最佳地利用有價值的細胞和材料。BIO ONE打印頭的冷卻功能允許自動和精確地分配 細胞膠原蛋白。在這項研究中，與傳統(tǒng)的鑄造全孔板的方法相比，膠原蛋白液滴的消耗減少了800%以上。打印PLURONICS 支持屏障允許更復雜的膠原蛋白圖案，并可以產生各種形狀。
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