微生物菌種凍干保藏法具體操作說明
微生物廣泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，包括細(xì)菌、螺旋體、立克次體、衣原體、支原體、放線菌、真菌、病毒等類，其結(jié)構(gòu)簡單，以單細(xì)胞、細(xì)胞群體或非細(xì)胞狀態(tài)存在，在提供營養(yǎng)物質(zhì)和適宜環(huán)境的條件下，一般都能獨立生活，迅速生長繁殖。微生物菌種可培養(yǎng)的具有保藏價值的微生物純培養(yǎng)（株）。
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設(shè)計的。
微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形狀基本穩(wěn)定，以便于研究、交換和使用的目的。微生物菌種常規(guī)保藏法分為定期移植保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、低溫冷凍保藏法和冷凍干燥保藏法5種。
下面來詳細(xì)了解微生物菌種凍干保藏方法：
菌種凍干保藏方法亦稱凍干法,是在無菌條件下將欲保藏的菌種制成懸浮液后凍結(jié),在真空條件下使冰升華直至干燥,從而使微生物的生理活動趨于停止面長期維持存活狀態(tài)的一種菌種保藏方法。凍干機(jī)適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：
1、安瓿管準(zhǔn)備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準(zhǔn)備
在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行))，與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。
4、預(yù)凍
一般預(yù)凍2小時以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：
安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的最-高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
8、質(zhì)量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。
微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設(shè)計的。
微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形狀基本穩(wěn)定，以便于研究、交換和使用的目的。微生物菌種常規(guī)保藏法分為定期移植保藏法、液體石蠟保藏法、沙土管保藏法、低溫冷凍保藏法和冷凍干燥保藏法5種。
下面來詳細(xì)了解微生物菌種凍干保藏方法：
菌種凍干保藏方法亦稱凍干法,是在無菌條件下將欲保藏的菌種制成懸浮液后凍結(jié),在真空條件下使冰升華直至干燥,從而使微生物的生理活動趨于停止面長期維持存活狀態(tài)的一種菌種保藏方法。凍干機(jī)適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟，其操作流程如下：
1、安瓿管準(zhǔn)備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準(zhǔn)備
在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行))，與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。
4、預(yù)凍
一般預(yù)凍2小時以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：
安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的最-高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯-化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
8、質(zhì)量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。
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