今天，給大家分享3月號發(fā)布的一篇新文章

iScience雜志（影響因子5.08）

《Biomimetic proteolipid vesicles for reverting GPI deficiency in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria》
這項研究旨在探索一種新的納米囊泡載體，使用微流體技術(shù)將人體膜蛋白與合成磷脂在Y型芯片上制備為新型仿生蛋白膜囊泡（BPLVs），用于在恢復(fù)陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿（PHN））患者特定細(xì)胞中釋放缺失的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白。研究結(jié)果表明，BPLVs可成功地遞送GPI-錨定蛋白到缺失的PNH細(xì)胞中，并且這些細(xì)胞對補體介導(dǎo)的溶解表現(xiàn)出增強的抵抗力。通過使用PE-rhodamine標(biāo)記的BPLVs，研究人員觀察到紅細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞（PBMCs）對BPLVs的優(yōu)異攝取能力，且PBMCs顯示出更強的攝取能力。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，BPLVs可提高細(xì)胞對補體介導(dǎo)溶解的抵抗力，尤其是PNH細(xì)胞�？傮w而言，這項研究為治療PNH相關(guān)癥狀提供了一種創(chuàng)新的方法，BPLV 可作為有效的納米載體，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞，以恢復(fù)PNH病的蛋白質(zhì)缺乏。

（技術(shù)線路圖）

脂質(zhì)納米顆粒是藥物遞送的新領(lǐng)域，因為它們成功地克服了藥物遞送的常見問題，如生物利用度低、半衰期短、藥物不穩(wěn)定、可能產(chǎn)生副作用以及缺乏靶向遞送等。脂質(zhì)納米顆�？刹捎貌煌�的技術(shù)制造，如薄膜水合、超臨界流體工藝或微流體方法。在微流控方案中，乙醇和水相會在微通道內(nèi)混合，如果工藝參數(shù)（如流速和流速比）優(yōu)化得當(dāng)，就能獲得單層單分散納米顆粒。與其他技術(shù)相比，微流控方法還具有放大可行性、更高的封裝效率和出色的批次間可重復(fù)性，以及長期懸浮的穩(wěn)定性。脂質(zhì)納米載體通常顯示出較低的全身毒性，可用于配制注射系統(tǒng)，這一點已在幾種封裝藥物的商業(yè)制劑中得到證實，如抗腫瘤分子、抗生素、抗真菌藥物或麻醉劑，以及核酸或 mRNA 疫苗。

蛋白脂納米載體是藥物遞送領(lǐng)域的一項新技術(shù)，通過在合成脂質(zhì)納米載體中整合白細(xì)胞衍生的膜蛋白而獲得，類似于白細(xì)胞的生理活動，如細(xì)胞粘附和炎癥調(diào)節(jié)。在體外和體內(nèi)模型中，這些納米載體在減少中性粒細(xì)胞浸潤和促進(jìn)炎癥消退方面具有巨大潛力。

在該文獻(xiàn)中，作者介紹了使用銳訊生物科技有限公司生產(chǎn)的NanoGenerator Flex M微流控設(shè)備和Y型芯片，配制仿生蛋白脂囊泡BPLVs，作者首先優(yōu)化了 BPLV 組裝的微流控條件，并將合成脂質(zhì)和從健康供體外周血單核細(xì)胞（PBMC）獲得的膜蛋白混合在一起。隨后，我們對功能化 BPLV 的大小、形態(tài)、表面電荷和細(xì)胞毒性進(jìn)行了表征，并在健康和病理人類原代細(xì)胞上對其治療 PNH 的潛力進(jìn)行了體外測試。

（仿生蛋白脂囊（BPLV）的表征）

BPLV 的物理表征方法是：

（A）動態(tài)光散射（DLS）分析，顯示出具有負(fù) zeta 電位的均勻群體（多分散指數(shù)，PDI），這是細(xì)胞膜相互作用的最佳狀態(tài)；

（B）Nanosight 確認(rèn)了顆粒大小的均勻分布，并獲得了顆粒濃度。數(shù)據(jù)以平均值 G 標(biāo)準(zhǔn)差 (SD) 表示。

  (C)  透射電子顯微鏡還研究了 BPLV 的形態(tài)，并使用磷鎢酸溶液（2% w/v）對脂質(zhì)層進(jìn)行染色，從而觀察到空的 BPLV（左圖）和負(fù)載的 BPLV（右圖）中的單脂質(zhì)層。

流式細(xì)胞術(shù)研究了 BPLV 的表面蛋白表達(dá)，首先根據(jù)同時存在的羅丹明標(biāo)記磷脂和人類膜蛋白（CD3）對顆粒進(jìn)行了鑒定。計算了這些顆粒上 Flaer+ 、CD33+ 、CD14+ 、CD45+ 和 HLA-DR+ 囊泡的百分比，并通過除以染色樣本的 MFI/未染色對照的 MFI，計算了中位熒光強度（MFI）倍數(shù)變化。

銳訊NanoGenerator Flex M微流控系統(tǒng)配備了一個內(nèi)徑為 600 毫米（總長度為 10 毫米）的 Y 型交錯人字形微攪拌器芯片，流速設(shè)定為 4 mL/min，乙醇中的總脂質(zhì)濃度為 17.5 mg/mL（乙醇/水相比例為 1:2），最終脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的比例為 1:35。具體而言，有機相由 1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DPPC）、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DOPC）和膽固醇組成。在脂質(zhì)混合物中加入標(biāo)記的 PE-羅丹明（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-利薩明羅丹明 B 磺酰）作為 BPLV 紅色示蹤劑，濃度為脂質(zhì)相總量的 0.5%。水相加有從健康和 PNH PBMCs 提取的膜蛋白總提取物。然后將試劑裝入 15 mL 試管并連接到微流控電路，直接施加預(yù)設(shè)壓力，以 4 mL/min 的總恒定流速將溶液推入混合芯片。然后，將混合溶液收集到端接芯片的 15 mL 清潔試管中。作者測試了低于或高于 4 mL/min 的流速，但得到的囊泡粒徑分布更大。作者選擇的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的比例（1:35）確保了極佳的蛋白質(zhì)負(fù)載。因此，他們的配方顯示出巨大的放大潛力，同時具有良好的負(fù)載和產(chǎn)品穩(wěn)定性，這對大規(guī)模體外和體內(nèi)研究極為重要。

（紅細(xì)胞（RBC）對仿生蛋白脂囊（BPLV）的吸收）

通過共聚焦顯微鏡研究了囊泡的吸收情況，BPLV 被標(biāo)記為 PE 羅丹明示蹤劑（紅色信號），而 RBC 膜則被標(biāo)記為親脂性染料（DiO 親脂性示蹤劑，綠色信號）。吸收了 BPLV 的紅細(xì)胞顯示出強烈的紅色或合并的橙色信號。

(A) 親脂性示蹤劑 DiO 染色 RBC 膜（綠色信號），吸收了 PE 羅丹明 BPLV 的 RBC 顯示紅色或橙色（合并）信號。更高倍放大（10 倍變焦）的 RBC，用于 BPLV 吸收的 PE 通道（B）、用于膜染色的 FITC 通道（D）和合并通道（C）。

PNH是BMF綜合征中的一種良性克隆性血液病，是由參與GPI錨生物合成的PIGA基因發(fā)生體細(xì)胞突變引起的，其特征是需要GPI錨才能正確定位在細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)（包括內(nèi)源性補體調(diào)節(jié)蛋白CD55和CD59）無法在膜上錨定。PNH 的癥狀繼發(fā)于補體誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解，如血管內(nèi)紅細(xì)胞溶解和血栓形成，從而導(dǎo)致貧血和血栓事件。血栓形成是 PNH 患者死亡的主要原因，占死亡人數(shù)的 40% 以上，可發(fā)生在任何部位，最常見的是肝靜脈（Budd-Chiari 綜合征，占患者的 7.5-25%）和腦靜脈。PNH 癥狀可通過補體抑制劑進(jìn)行藥物治療，以減少補體對 GPI 缺乏細(xì)胞的激活，從而改善其存活率。然而，PNH 克隆會積聚到外周血中，并在補體最大激活時（如細(xì)菌感染時）被溶解，從而超過補體抑制作用，導(dǎo)致突破性溶血，尤其是在新型補體抑制劑（如 ravulizu- mab）治療下。因此，需要采用不同的藥理學(xué)方法來改善 PNH 患者的臨床治療。在這項研究中，作者配制了攜帶 GPI-錨地定蛋白的 BPLVs，用于一種創(chuàng)新的治療方法，以獲得一種新的蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)來恢復(fù) PNH 細(xì)胞的 GPI 缺乏。

本文提供了一種治療 PNH 相關(guān)癥狀的創(chuàng)新方法，即用由人類膜蛋白和合成磷脂組成的BPLVs作為蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)，在不改變細(xì)胞基因組的情況下向 PNH 細(xì)胞釋放整套 GPI-anchored 蛋白質(zhì)。這種方法是 PNH 領(lǐng)域的一項創(chuàng)新，這種利用微流體技術(shù)將復(fù)雜蛋白質(zhì)提取物加入脂質(zhì)囊泡而制成的蛋白質(zhì)遞送平臺已被用于向 PNH 細(xì)胞遞送缺乏的蛋白質(zhì)。制備的囊泡是仿生的，沒有毒性，與細(xì)胞膜的親和力極強，因此能很好地吸收和輸送蛋白質(zhì)，從而有效地恢復(fù) PNH 克隆細(xì)胞的蛋白質(zhì)缺乏癥。這項研究成果開辟了新的治療方案，因為細(xì)胞表型的改變無需引入 DNA 的變化，從而克服了與使用病毒載體或其他基因組修飾劑有關(guān)的所有技術(shù)問題。這些改變很可能是短暫的，因為它們依賴于細(xì)胞的壽命，沒有在細(xì)胞基因組中引入永久性改變。這可能是一個不利因素，因為患者可能需要長時間的治療；反之，通過劑量和時間調(diào)節(jié)，與治療相關(guān)的不良反應(yīng)可能會得到更好的控制。這個系統(tǒng)還可進(jìn)一步用于在納米載體中加入嵌合受體或其他重組蛋白，以實現(xiàn)先進(jìn)的給藥功能，治療由特定蛋白缺乏引起的各種疾病。盡管研究結(jié)果非常令人鼓舞，但還需要在更多的體外和體內(nèi)研究中進(jìn)一步驗證。


原文：https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109021