本綜述文章概述了光合作用氣體交換測量的基本原理，并就如何獲取測量數(shù)據(jù)和正確解釋數(shù)據(jù)提供最佳實(shí)踐指南。它旨在為新手提供氣體交換技術(shù)方面的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為有經(jīng)驗(yàn)的研究人員提供參考。
 

通過光合作用氣體交換測量，可以從機(jī)理上深入了解植物葉片中碳和水通量的基本過程，進(jìn)而了解從單個(gè)細(xì)胞到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)等不同尺度的相關(guān)過程。鑒于光合作用對全球氣候討論的重要性，學(xué)界普遍認(rèn)為以下兩點(diǎn)需要提升：1.廣大研究人員應(yīng)對所使用實(shí)驗(yàn)方法的基本原理有最基本的了解；2. 明確相關(guān)研究的最佳實(shí)踐指南和正確的數(shù)據(jù)解釋。2024年2月6日，Plant, Cell & Environment雜志刊發(fā)了英國伯明翰大學(xué)等多家單位署名的綜述文章，標(biāo)題為A guide to photosynthetic gas exchange measurements: Fundamental principles, best practice and potential pitfalls。在該綜述中，F(xiàn)lorian A. Busch等人概述了可通過氣體交換測量方法研究的光合作用生物化學(xué)和生物物理參數(shù)，并就如何可靠地測量這些參數(shù)提供了逐步指導(dǎo)。此外，文章還提供了使用氣體交換設(shè)備的最佳實(shí)踐建議，并強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)解讀中可能存在的誤區(qū)。補(bǔ)充信息包含示例數(shù)據(jù)集、實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)建模流程。這篇綜述是一項(xiàng)團(tuán)隊(duì)協(xié)作的成果，旨在讓實(shí)驗(yàn)研究人員和數(shù)據(jù)建模人員扎實(shí)了解氣體交換測量的理論基礎(chǔ)、不同實(shí)驗(yàn)方案背后的原理以及數(shù)據(jù)解讀方法。

幾十年來，使用紅外氣體分析儀(IRGAs)的氣體交換技術(shù)已被廣泛用于測量進(jìn)出葉片的CO₂和H₂O通量，非葉片組織的通量測量則較少使用。通過這些測量可以評估葉片的生理活性，并確定光合作用的生化能力。對葉片水平氣體交換的測量有助于從機(jī)理上理解決定碳和水通量的分子過程，并為理解生態(tài)系統(tǒng)功能提供信息。目前的商用氣體交換系統(tǒng)在腔室設(shè)計(jì)和分析器設(shè)置方面的技術(shù)創(chuàng)新由來已久，這些系統(tǒng)精確、便攜，而且相對易于使用。從熱帶到北極，從草原到森林再到農(nóng)田，這些系統(tǒng)廣泛應(yīng)用在不同的生態(tài)系統(tǒng)中原位測量光合作用二氧化碳同化(A)和氣孔導(dǎo)度(g_s)。

氣體交換測量可檢驗(yàn)葉片和大氣之間的CO₂和H₂O通量如何隨著葉室內(nèi)環(huán)境條件的變化而變化，以及不同環(huán)境條件下的長期生長如何影響光合作用的速率、生化能力和擴(kuò)散限制。氣體交換測量還增進(jìn)了人們對進(jìn)行不同類型光合作用物種(如 C3、C4和CAM)的生理學(xué)了解。

學(xué)界之前曾出版過幾本氣體交換入門指南，大多側(cè)重于特定測量技術(shù)的細(xì)節(jié)。在下文中，F(xiàn)lorian A. Busch等人將概述可通過氣體交換測量來研究的生物化學(xué)和生物物理相關(guān)的光合作用過程，并概述可估算的參數(shù)。然后，文章還將討論在C3植物中利用光合氣體交換技術(shù)量化這些參數(shù)的合適方法，C3植物是光合作用的主要途徑。不過，在許多情況下，這些方法經(jīng)適當(dāng)修改后也可應(yīng)用于C4或CAM光合作用的物種，本文同樣會涉及一些。

雖然使用目前市售設(shè)備記錄氣體交換數(shù)據(jù)相對容易，但獲得的數(shù)據(jù)并不一定有意義。正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)解釋對于獲得高質(zhì)量的信息至關(guān)重要。因此，F(xiàn)lorian A. Busch等人在本綜述中提供了以往指南中沒有的 "操作方法"提示。當(dāng)然，商用氣體交換設(shè)備的具體設(shè)計(jì)因制造商而異，讀者應(yīng)參考制造商的操作手冊。我們的建議和術(shù)語基于當(dāng)前的通用做法，但在我們認(rèn)為新方法有益的地方會有所偏離。其中尤其包括對光響應(yīng)曲線擬合的新建議。因此，這篇綜述將為新手打下堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員提供一些新思路�？傊�，作者的目的是概述有助于成功測量的步驟，但同時(shí)也注意到，這些建議可以而且可能必須針對具體的研究問題進(jìn)行修改。

從氣體交換測量獲得的關(guān)鍵參數(shù)
光合作用的CO₂固定是一系列復(fù)雜生物化學(xué)和生物物理過程的結(jié)果，其中許多過程都可以通過氣體交換技術(shù)進(jìn)行測量。氣體交換測量可讓我們了解碳和水關(guān)系的各個(gè)方面，從與依賴光和不依賴光反應(yīng)相關(guān)的過程到CO₂/H₂O擴(kuò)散和葉片的吸收匯能力。氣體交換測量直接提供給我們的唯一信息是CO₂和H₂O的濃度以及相關(guān)的凈通量。不過，根據(jù)某些假設(shè)，可以從這些數(shù)值間接估算出一系列參數(shù)。這些參數(shù)可粗略地分為三類(圖1，表1)：第一類說明了葉片的"最大"能力，該類型的參數(shù)描述了葉片在不同光合作用方面投入的內(nèi)在特性。這些參數(shù)可能對溫度有固定的反應(yīng)，也可能在葉片的整個(gè)生長過程中發(fā)生變化，但在其他情況下可被視為常數(shù)。第二類是葉片當(dāng)前的生理狀態(tài)，即測量期間實(shí)現(xiàn)的 "瞬時(shí)"或 "有效"速率。這些變量會隨著光照強(qiáng)度、大氣[CO₂]或水分狀況等環(huán)境條件的變化而在短期內(nèi)(幾秒到幾小時(shí))發(fā)生變化。第三類包括描述光合作用性能在某些特定方面的參數(shù)，這類參數(shù)可能并不直接對應(yīng)某個(gè)單一可識別生理性狀。例如，A從一種生化限制過渡到另一種限制時(shí)的CO₂濃度，或限制A 的不同生理過程的相對貢獻(xiàn)。
 

圖1. 如何為自己的研究問題選擇正確的測量參數(shù)。光合特性可分為描述生化和氣體擴(kuò)散特性的性狀以及進(jìn)入或流出葉片的氣體通量。因此，第一步是確定氣體交換測量要評估的性狀大類。然后是所關(guān)注的光合特性是與葉片的固有特性有關(guān)，還是與葉片在特定環(huán)境條件下的運(yùn)行狀態(tài)有關(guān)。其他更具描述性的特性也可以通過氣體交換測量來估算。為支持研究問題，文章給出了可以量化的參數(shù)，以及適用每種參數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法，詳細(xì)說明見補(bǔ)充資料 S1。參數(shù)和變量的定義見表 1。
 

表1 環(huán)境條件下的光合氣體交換參數(shù)、單位和典型值
 

最大氣體交換能力、通量和導(dǎo)度
光合作用生理生化過程的最大氣體交換能力由三個(gè)變量決定：1. 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化的最大速率(V_cmax)代表卡爾文-本森-巴塞爾循環(huán)(CBB)中 RuBP 的消耗能力，其中核酮糖-二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco) 被認(rèn)為是關(guān)鍵的限速步驟。2. 光合電子傳遞的最大速率(J_cmax)代表參與 RuBP 再生的所有過程，它被認(rèn)為受到光系統(tǒng) II(PSII)的水分分解速率和/或通過細(xì)胞色素 b6f 的電子傳遞速率的限制。V_cmax和 J_cmax是葉綠體二氧化碳濃度(或J_cmax的光照強(qiáng)度)為無限時(shí)理論上可以達(dá)到的速率，除 Rubisco羧化(或電子傳輸)外，沒有其他過程受到限制。3. 磷酸三糖的最大利用率T_pmax與葉綠體合成淀粉或輸出蔗糖的能力有關(guān)。T_pmax可能反映了其他植物器官代謝或儲存新同化物的限制，因此是描述植物整體吸收能力的 CBB 循環(huán)的下游。這三個(gè)參數(shù)是模擬 A 對環(huán)境條件反應(yīng)的核心。

一組參數(shù)描述了特定環(huán)境條件下凈CO₂或H₂O交換的最大速率。例如，A_max描述的是當(dāng)光照和[CO₂]達(dá)到飽和，Rubisco 加氧受到很大抑制時(shí)的最大CO₂同化速率。A_sat是環(huán)境CO₂濃度和光飽和條件下的凈CO₂同化率，因此是自然環(huán)境光照波動條件下可達(dá)到的最大同化能力的良好指標(biāo)。在一定溫度范圍內(nèi)的最大CO₂凈同化率稱為 A_opt。該參數(shù)有助于從功能上描述凈光合作用對溫度的響應(yīng)。

在CO₂同化通量進(jìn)入葉片的同時(shí)，CO₂還通過線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的脫羧過程從呼吸和光呼吸中釋放出來。為簡單起見，并與傳統(tǒng)術(shù)語一致，這里將非光呼吸的CO₂釋放總和稱為"線粒體"呼吸。黑暗中的呼吸速率(R_dark)在晝夜間有些變化，但總體而言是葉片線粒體活動的良好指標(biāo)。R_dark是衡量植物在24小時(shí)晝夜過程中總體碳吸收量的一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)楹粑�作用在整個(gè)夜間持續(xù)進(jìn)行，抵消了白天的碳增量。由于碳吸收量是光合作用的CO₂吸收量和呼吸作用的CO₂釋放量的組合，要模擬白天的碳吸收量對環(huán)境條件的響應(yīng)，就必須了解光照下的呼吸作用(R_light)。一些證據(jù)表明，呼吸作用在光照下會受到部分抑制，這突出表明需要對R_light進(jìn)行單獨(dú)測量，以確定光合作用模型的參數(shù)。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，R_dark和R_light之間的差異可能在很大程度上是由于光照強(qiáng)度變化時(shí)葉綠體CO₂濃度(C_c)發(fā)生了不可解釋的變化，這意味著對 R_dark的測量可能足以對模型進(jìn)行參數(shù)化：R_dark和R_light通常指的是流出葉片的呼吸通量，而光合作用模型通常基于細(xì)胞內(nèi)水平的呼吸通量(表示為R_d)。它們的區(qū)別在于流出葉片前被再固定的CO₂量，據(jù)估計(jì)，從線粒體到細(xì)胞間隙的過程中，再固定的CO₂量約為 24%-38%。如果假定光照不會抑制呼吸作用，則可將R_d設(shè)為R_dark。值得注意的是，作為葉片層面的屬性，呼吸作用與CO₂同化的符號相同，是一種 "正 "通量，盡管方向相反。
 

瞬時(shí)速率或有效速率和導(dǎo)度
描述特定環(huán)境條件下光合作用有效特性的最重要變量是瞬時(shí)CO₂凈同化速率(A；通常也稱作A_net)和蒸騰速率(E)，這可以通過氣體交換直接測量(見Box1)。根據(jù)這些變量，我們可以估算出植物在當(dāng)前條件下的瞬時(shí)水分利用效率(WUE)，即A與E之比。然而，E不僅取決于植物的生理狀態(tài)和氣孔的開放程度，還受到葉片內(nèi)部與周圍空氣之間的蒸汽壓差(VPD_leaf)的很大影響。因此，E本身并不能告訴我們植物的內(nèi)在狀態(tài)，也不能告訴我們 WUE如何隨著環(huán)境條件的變化而變化。因此，內(nèi)在水分利用效率(iWUE)是對H₂O損失和CO₂吸收之間權(quán)衡的一種更生理學(xué)的描述，它表示為A與氣孔對水蒸氣的導(dǎo)度(阻力的倒數(shù))之比(g_sw)。

除了生化參數(shù)的最大能力外，我們還可以從氣體交換中獲得在特定環(huán)境條件下實(shí)現(xiàn)的相應(yīng)值。實(shí)際光合電子傳遞速率(J_a)與依賴光的光合反應(yīng)的當(dāng)前狀態(tài)有關(guān)，既反映了可用于驅(qū)動電子傳遞的光能，也反映了當(dāng)前利用CBB循環(huán)中產(chǎn)生的NADPH和ATP的能力。與光無關(guān)的光合反應(yīng)活性由Rubisco當(dāng)前的羧化速率(V_c)和氧合作用速率(V_o)表示。根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)，我們可以推斷出通過 CBB 循環(huán)和光呼吸途徑的通量。最后，我們還可以量化任何特定環(huán)境條件下磷酸三糖的有效利用率(T_p)。這四個(gè)參數(shù)都不是通過氣體交換直接測量的，而是借助下文所述的光合作用生化模型從A和E中推導(dǎo)出來的。
 

描述光合作用性能的其他特性
氣體交換測量還可提供具有描述性的其他參數(shù)，有助于植物或處理之間的比較。這些參數(shù)包括A達(dá)到光飽和(I_sat)時(shí)的入射光強(qiáng)度(I_inc；通常也稱為Q)、光補(bǔ)償點(diǎn)(I_c)和CO₂補(bǔ)償點(diǎn)(Γ)，它們描述了光合作用和呼吸作用達(dá)到平衡(A=0)時(shí)的光強(qiáng)度或CO₂濃度，以及光合作用達(dá)到最佳(T_opt)時(shí)的葉片溫度(T_leaf)。我們甚至可以通過限制分析得出參數(shù)，回答 "如果 "問題，限制分析的目的是量化由于氣孔或生化限制而放棄的CO₂吸收量。例如，相對氣孔限制(l_s)探究了氣孔干擾CO₂擴(kuò)散導(dǎo)致A值減少的程度，或者相對生化限制(l_b)量化了 Rubisco未完全激活對A值的相對影響。

上述一長串參數(shù)雖然并不全面，但卻體現(xiàn)了可以從光合氣體交換測量中提取的信息的多樣性。它們提供了有關(guān)植物生理狀態(tài)的重要信息，并可隨著植物的老化和發(fā)育或?qū)Νh(huán)境因素的反應(yīng)而進(jìn)行跟蹤。要量化每個(gè)參數(shù)，都需要遵循一定的測量策略。雖然可以通過相對簡單的調(diào)查測量來研究瞬時(shí)光合通量、呼吸通量和透氣通量，但確定光合氣體交換能力和限制的參數(shù)和性狀需要對A對環(huán)境參數(shù)(如[CO₂]、光照或溫度)的反應(yīng)進(jìn)行更復(fù)雜的測量。下面我們將介紹哪些測量方法最適合獲得所選參數(shù)，以及如何控制IRGA以獲得可靠的數(shù)值。
 

與氣體交換測量相關(guān)的 3 個(gè)光合作用生理原理
測量和解釋光合作用氣體交換具有挑戰(zhàn)性，主要有兩個(gè)原因。首先，在測量過程中，光合作用對光照、溫度、濕度和空氣中的氣體成分反應(yīng)強(qiáng)烈，這意味著在測量光合作用本身的同時(shí)，需要嚴(yán)格控制和測量這些因素。其次，雖然氣體交換測量通常確定的是凈氣體交換量，但觀測結(jié)果通常反映的是幾種綜合過程的總通量。例如，CO₂凈交換量包括 CBB 循環(huán)中與RuBP羧化相關(guān)的CO₂吸收通量，以及呼吸作用和光呼吸過程中釋放的CO₂。在一系列不同條件下進(jìn)行的測量使我們能夠?qū)⑦@些凈通量分解為其總成分，這將在隨后的章節(jié)中進(jìn)一步解釋。

光合氣體交換的決定因素可分為擴(kuò)散限制和生化限制。CO₂要被C3植物固定，首先必須穿過葉片周圍靜止空氣的邊界層，然后通過氣孔穿過表皮層，到達(dá)葉片的細(xì)胞間氣體空間(IAS)。在到達(dá)CO₂固定地點(diǎn)之前，還需要經(jīng)過細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體包膜和部分基質(zhì)等一系列擴(kuò)散障礙(見圖 2)。從周圍空氣(C_a)到 IAS(C_i)，再從 IAS 到葉綠體基質(zhì)(C_c)的CO₂濃度梯度推動了這一擴(kuò)散途徑中的CO₂凈轉(zhuǎn)移。這些梯度是由葉綠體基質(zhì)通過 CBB 循環(huán)及其中心酶Rubisco的活性吸收CO₂形成的，而CBB循環(huán)及其中心酶Rubisco的活性又依賴于葉綠體類囊體膜上光化反應(yīng)產(chǎn)生的ATP和還原劑NADPH。

圖2. 葉片內(nèi)H₂O和CO₂擴(kuò)散示意圖。如果已知邊界層對H₂O擴(kuò)散的導(dǎo)度(g_bw)，那么通過氣孔排出葉片飽和細(xì)胞間氣體空間(IAS)(w_i)中的水蒸氣可用于通過測量大氣中的水蒸氣濃度(w_a)來量化氣孔對H₂O擴(kuò)散的導(dǎo)度(g_sw)。在氣體交換測量過程中，使用高速風(fēng)扇的氣體交換室會將邊界層降至最低，因此可以使用經(jīng)驗(yàn)值對其進(jìn)行合理的計(jì)算。由此，我們可以描述CO₂反向擴(kuò)散到IAS的路徑，還需要額外的信息來描述向葉綠體(C)擴(kuò)散的路徑。通過邊界層(g_bc)、氣孔(g_sc)和葉肉(g_m)進(jìn)行CO₂擴(kuò)散的有限傳導(dǎo)可被視為擴(kuò)散阻力，它導(dǎo)致大氣中的CO₂濃度(C_a)逐漸下降到細(xì)胞間隙中的CO₂濃度(C_i)和葉綠體中的CO₂濃度(C_c)。C_c和葉綠體中的氧氣濃度決定了Rubisco羧化(V_c)和加氧(V_o)的相對速率。在加氧反應(yīng)之后，光呼吸CO₂從線粒體(M)中釋放出來，其中還涉及過氧物酶體(P)中的一些反應(yīng)。

要分析光合作用的生化限制，首先需要確定CO₂轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散軌跡參數(shù)。在這方面，需要同時(shí)測量水蒸氣交換。與進(jìn)入葉片的CO₂凈轉(zhuǎn)移類似，葉片外的水分轉(zhuǎn)移也是由擴(kuò)散決定的。從水蒸氣可被假定為飽和(或在中低VPD條件下接近飽和)的IAS開始，水蒸氣沿著蒸汽壓力梯度向葉片周圍較干燥的空氣擴(kuò)散。在大多數(shù)情況下，蒸騰作用造成的水分損失主要與通過氣孔的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移有關(guān)，不過觀測到的水分釋放率也可能包括通過角質(zhì)層從葉片中流出的水分(見Box2)。
 

光合作用機(jī)理模型
除A、R_d和E外，大多數(shù)光合作用氣體交換參數(shù)都無法直接測量，而是借助生化模型，根據(jù)A對環(huán)境參數(shù)(如CO₂濃度或光照強(qiáng)度)變化的反應(yīng)推導(dǎo)得出。對于C3光合作用，通常采用Farquhar等人1980 年提出的模型(以下簡稱 FvCB)，von Caemmerer在2000年對該模型進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。我們對FvCB模型進(jìn)行了簡明扼要的概括，并采用了一些對參數(shù)估計(jì)有用的修改(見Box3)。在其基本形式中，F(xiàn)vCB模型側(cè)重于光合作用吸收CO₂的主要原理，并將CBB循環(huán)反應(yīng)的全部內(nèi)容濃縮為Rubisco的活動等。不過，該模型可以進(jìn)行調(diào)整，以解決新問題和參數(shù)估計(jì)的需要。本文討論的許多光合作用參數(shù)可以通過將機(jī)理模型與不同環(huán)境條件下獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(如CO₂濃度或光照強(qiáng)度)進(jìn)行擬合來量化。
 

反過來，在已知光合作用參數(shù)的情況下，F(xiàn)vCB模型可以預(yù)測多種環(huán)境條件下的CO₂同化。因此，F(xiàn)vCB模型已被廣泛集成到冠層、生態(tài)系統(tǒng)和全球碳通量模型中。由于光合氣體交換參數(shù)在地球系統(tǒng)模型中的核心地位，人們在描述模型參數(shù)的遺傳、發(fā)育和環(huán)境變異方面做出了巨大努力。
 

適合估算單個(gè)光合作用參數(shù)的 5 種測量類型
在前面的章節(jié)中，我們討論了可從氣體交換測量中得出的主要光合作用參數(shù)，以及這些參數(shù)與我們對光合作用功能的理解之間的關(guān)系。補(bǔ)充資料S1中概述了一系列"如何"可靠估算這些光合作用參數(shù)的實(shí)驗(yàn)程序。其中包括調(diào)查測量、A/C_i響應(yīng)、A/I_inc 響應(yīng)、A/T響應(yīng)、Laisk和Kok測量的程序，以及其他較少應(yīng)用的光合作用測量的簡要說明。對于補(bǔ)充資料S1中的建議，我們總結(jié)了整體來說我們認(rèn)為的 "最佳實(shí)踐"。不過，有必要重申的是，不同的問題需要不同的測量方法，而且每個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置在設(shè)備和可用時(shí)間方面都有不同的限制，因此必須做出折衷。因此，我們的建議應(yīng)被視為設(shè)計(jì)個(gè)性化方法的起點(diǎn)。

估算光合作用參數(shù)的模型擬合程序
通過非線性曲線擬合程序，可從CO₂響應(yīng)曲線(即V_cmax、J和T_pmax)和光響應(yīng)曲線 (J_max)估算光合作用能力參數(shù)，以最大限度地減小收集的CO₂同化數(shù)據(jù)(A)與根據(jù) FvCB 方程(公式18)模擬的基本預(yù)測A之間的差異。常用的數(shù)據(jù)分析工具包括基于Excel電子表格的光合響應(yīng)曲線擬合方法、用于獲得類似非線性擬合輸出的R軟件包(如plantecophys、plantecowrap、photosynthesis和msuRACiFit)，甚至還有返回?cái)M合數(shù)據(jù)的在線服務(wù)(如 leafweb.org)。盡管無論使用哪種工具，標(biāo)準(zhǔn)的A/C_i曲線擬合程序都基于相同的理論，但由于方法的特定固有假設(shè)和缺點(diǎn)，參數(shù)估計(jì)會出現(xiàn)差異。例如，基于電子表格的擬合工具對許多熟悉Excel求解器插件的生理學(xué)家來說都是可用的，但要求用戶對限制因素做出判斷，并指定從RuBP飽和到RuBP限制A的過渡，以分別求解V_cmax和J。因此，使用這種方法進(jìn)行估算需要依靠用戶經(jīng)驗(yàn)做出主觀判斷，而且必須對每條曲線進(jìn)行獨(dú)立分析。雖然這種方法可以深入了解支持每項(xiàng)測量的數(shù)據(jù)，但卻阻礙了大規(guī)模分析。廣泛使用的 plantecophys R軟件包通過在收集到的整個(gè)二氧化碳范圍內(nèi)將數(shù)據(jù)擬合為A_c、A_j和A_p的雙曲線最小值，從而避免了靠經(jīng)驗(yàn)指定數(shù)據(jù)限制的需要，不過過渡點(diǎn)可以固定，以便根據(jù)假設(shè)檢查擬合結(jié)果。采用基于編碼而非電子表格的曲線擬合程序的一大優(yōu)勢是減少了每條曲線的分析時(shí)間，提高了通量、可重復(fù)性和可共享性，但這取決于用戶對編程語言的適應(yīng)程度。下一代R軟件包正在出現(xiàn)，包括光合作用軟件包，其中不僅包含擬合A/C_i曲線的功能，還包含擬合A/I_inc曲線、R_light、葉肉和氣孔導(dǎo)度以及水力曲線的功能。在這一點(diǎn)上需要注意：不同統(tǒng)計(jì)軟件包之間的參數(shù)符號可能并不統(tǒng)一，可能與本文不同。同樣，用于擬合數(shù)據(jù)的函數(shù)也存在差異，尤其是用于擬合A/I_inc反應(yīng)的函數(shù)。

FvCB模型的準(zhǔn)確性取決于對Rubisco動力特性的正確表述，并需要對Rubisco Michaelis–Menten常數(shù)(K_c、K_o或空氣中的有效值K_m)和Γ*及其溫度依賴性(公式 22和23)進(jìn)行估算�，F(xiàn)在已經(jīng)從體外測量中獲得了這些參數(shù)的許多特定物種估計(jì)值，并顯示出物種間的巨大差異。然而，使用Rubisco動力溫度響應(yīng)的體外估算值可能會產(chǎn)生A的模型值，隨著溫度向冷暖極端移動，這些值會偏離觀察到的測量值。使用這些溫度函數(shù)需要假設(shè)體內(nèi)條件，如pH值和二氧化碳向羧化部位的擴(kuò)散，體外測定條件的差異可能會使這一假設(shè)變得更加復(fù)雜。但另一方面，體外獲得的動力學(xué)參數(shù)不需要知道C_c或每次 Rubisco 加氧反應(yīng)釋放的CO₂量(λ)，這可能是最重要的誤差來源。光合作用對氧氣或二氧化碳濃度變化的敏感性可獨(dú)立確定光合作用的基本限制。

影響二氧化碳響應(yīng)曲線估計(jì)值的另一個(gè)參數(shù)是葉肉導(dǎo)度(g_m)，它影響葉綠體內(nèi)二氧化碳的有效分壓，因此會影響擬合的V_cmax。低g_m會降低A/C_i曲線的曲率，如果有獨(dú)立的測量值，電子表格和基于編碼的曲線擬合工具都可以將其考慮在內(nèi)。如果沒有獨(dú)立的測量值，則可通過在等式 22 和 23 中用(C_i - A/g_m)代替C_c，并使用非線性曲線擬合來估算g_m，以盡量減少與觀測數(shù)據(jù)之間的差異。獨(dú)立的g_m測量值可通過穩(wěn)定碳同位素技術(shù)、氣體交換與葉綠素?zé)晒鉁y量相結(jié)合或曲線擬合等方法獲得。曲線擬合法假定g_m恒定不變，而穩(wěn)定碳同位素技術(shù)可用于評估g_m在不同環(huán)境條件下的變化情況。

氣體交換（光合儀）的良好操作規(guī)范

測量前的基本檢查

在機(jī)器預(yù)熱期間，執(zhí)行制造商建議的測試。這可能包括檢查溫度參數(shù)和傳感器的準(zhǔn)確性和響應(yīng)性、照明控制和葉室氣體混勻風(fēng)扇的功能。

定期標(biāo)定和校準(zhǔn)機(jī)器

由于老化(如紅外光強(qiáng)度降低)或由于吸收紅外線的顆粒(如灰塵)累積而衰減，紅外氣體分析儀的信號會隨時(shí)間漂移。除了定期對IRGA的CO₂和H₂O進(jìn)行零點(diǎn)標(biāo)定之外，在測量開始前或?qū)�IRGA進(jìn)行維護(hù)(如清潔光學(xué)工作臺)時(shí)，根據(jù)低濃度和高濃度的參考?xì)怏w(截距和斜率)標(biāo)定IRGA的跨度也是一個(gè)不錯(cuò)的做法。對不同機(jī)器使用相同的標(biāo)定氣體可提高測量精度并減少儀器間偏差。

檢查氣路是否漏氣

每次將葉片放入葉室夾緊后，都必須檢查氣路是否漏氣。多孔海綿墊圈會吸收/釋放 CO₂和H₂O，可能會導(dǎo)致葉室內(nèi)外的微小通量。這些擴(kuò)散通量的相對影響在二氧化碳響應(yīng)曲線中使用的高[CO₂]和低[CO₂]條件下會加劇。如果外部CO₂已知，通�？梢詫ζ溥M(jìn)行校正(參見制造商的文檔)。第二種漏氣是由于墊片與葉片形狀(尤其是主要葉脈)不完全吻合，導(dǎo)致墊片與葉片接觸面出現(xiàn)縫隙。要檢測這種漏氣，應(yīng)在監(jiān)測室內(nèi)[CO₂]的同時(shí)將呼出的空氣吹到腔室附近。如果室內(nèi)的[CO₂]沒有出現(xiàn)尖峰，則表明沒有嚴(yán)重的漏氣。如果無法調(diào)整葉片在葉室內(nèi)的位置以避免漏氣，可小心使用真空硅脂密封葉室。如果無法避免漏氣，則可采用幾種方法進(jìn)行部分校正。

檢查密封墊片狀態(tài)

海綿墊片通常具有彈性，以適應(yīng)葉片的形狀。然而，隨著使用時(shí)間的推移，它們可能會偏離原來的位置或老化變平，從而降低與葉片保持良好密封的效果。建議在不進(jìn)行測量時(shí)或在儲存期間將葉室置于打開狀態(tài)，以延長密封墊片的壽命。

在測量過程中檢查穩(wěn)定性

在進(jìn)行葉片氣體交換測量時(shí)，重要的是至少在短時(shí)間內(nèi)(幾分鐘)進(jìn)入葉室的空氣中的 [CO₂]和 [H₂O]保持穩(wěn)定。如果沒有使用機(jī)器的氣體混合器自動控制，則可以通過使用緩沖瓶來抑制環(huán)境氣流的快速波動并實(shí)現(xiàn)進(jìn)入儀器的氣體濃度穩(wěn)定。

監(jiān)控系統(tǒng)參數(shù)

試驗(yàn)室條件會在無意中迅速變化，例如，葉片溫度會隨光照強(qiáng)度迅速升高，這也會影響VPD_leaf。動態(tài)控制葉片溫度而不是保持葉室溫度恒定可以避免T_leaf的變化，但在光照強(qiáng)度變化后，由于進(jìn)入的空氣溫度和水蒸氣的快速變化與葉室條件達(dá)到新的平衡，可能會在測量中產(chǎn)生瞬時(shí)距離波動(如氣孔導(dǎo)度的大幅飆升)。g_s和/或VPD_leaf的變化也會影響葉室內(nèi)空氣的相對濕度(RH)，并有可能達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，務(wù)必時(shí)刻監(jiān)測葉室內(nèi)的露點(diǎn)溫度，以避免出現(xiàn)冷凝現(xiàn)象，尤其是在低流速和高葉片蒸騰量的情況下。在輸入控制此參數(shù)時(shí)對其進(jìn)行查看也很重要，這樣可以在時(shí)間過長而需要重復(fù)測量之前發(fā)現(xiàn)氣孔閉合或CO₂鋼瓶耗盡等情況。

最大限度地提高信噪比

雖然葉室內(nèi)氣體的高流速可加快測量響應(yīng)速度，但同時(shí)也會降低參考和樣品IRGA之間測得的[CO₂]和[H₂O]差值。當(dāng)濃度差值過小時(shí)，當(dāng)IRGA的檢測極限大于所測得的差值時(shí)，光合作用和氣孔導(dǎo)度等計(jì)算數(shù)據(jù)就會變得嘈雜。減小通過葉室的氣流可以增大差值，有利于提高信噪比。然而，這同時(shí)也會增加潛在漏氣對測量的影響，因?yàn)榭諝庠谌~室內(nèi)的停留時(shí)間更長，腔體壓力更低，會加劇氣體通過墊片的擴(kuò)散泄漏。流速越低，葉片蒸騰作用對濕度控制的影響就越大，因?yàn)樗�蒸氣會在葉室內(nèi)積聚。建議從制造商推薦的流速值開始，然后根據(jù)葉片的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。

調(diào)整光質(zhì)組合比例

輻射光源通常由紅色和藍(lán)色波長的LED組合而成。長期以來，默認(rèn)情況是高比例的紅光用于驅(qū)動光合作用(90%)，少量藍(lán)光用于刺激氣孔開放(10%)。由于葉片吸收率取決于波長，不同比例的紅光和藍(lán)光強(qiáng)度會導(dǎo)致不同的光合作用測量值。關(guān)于紅光和藍(lán)光重要性的傳統(tǒng)觀點(diǎn)受到了質(zhì)疑，因?yàn)橛行┪锓N對藍(lán)光沒有反應(yīng)，而其他波長的光，如綠光和遠(yuǎn)紅光，可能在推動光合作用方面發(fā)揮重要作用。

匹配 IRGA

根據(jù)所使用的氣體交換系統(tǒng)，葉室內(nèi)外的CO₂和H₂O可能由兩個(gè)不同的IRGA測量，如果它們的標(biāo)定或響應(yīng)稍有不同，就會產(chǎn)生系統(tǒng)偏差。為了解決這個(gè)問題，可將相同的空氣同時(shí)通過兩個(gè)IRGA，并通過電子方式將濃度讀數(shù)"匹配"為相同的值。通常在[CO₂]和/或[H₂O]發(fā)生變化或設(shè)定時(shí)間(如30分鐘)后對IRGA進(jìn)行匹配。過于頻繁地進(jìn)行匹配，尤其是當(dāng)[CO₂]和/或[H₂O]發(fā)生瞬時(shí)變化時(shí)，可能無法獲得更準(zhǔn)確的測量結(jié)果。通常最好等測量結(jié)果穩(wěn)定后再進(jìn)行匹配(但這取決于系統(tǒng)，請查閱制造商手冊)。對于長期測量(如晝夜動力學(xué))，必須定期進(jìn)行匹配，因?yàn)镮RGA隨時(shí)間的漂移可能會妨礙晝夜節(jié)律對光合作用影響的解釋。

選擇合適的葉室尺寸

理想情況下，氣體交換室的大小應(yīng)與葉片尺寸成正比，因?yàn)楫?dāng)葉片覆蓋整個(gè)氣體交換室時(shí)，設(shè)置通常更容易操作。對于較小的葉室，由于空氣容量較小，反應(yīng)時(shí)間較快，而較大的葉室則受葉片異質(zhì)性(如氣孔斑塊)的影響較小，兩者之間需要權(quán)衡。氣孔斑塊是一種空間或時(shí)間異質(zhì)性，可能由相鄰氣孔之間的水力相互作用引起，并影響細(xì)胞間CO₂濃度測量的準(zhǔn)確性。因此，氣體交換葉室的大小應(yīng)與實(shí)驗(yàn)的要求和目的相匹配。

葉室氣流混勻風(fēng)扇的轉(zhuǎn)速

葉室氣流混勻風(fēng)扇可降低葉片周圍的邊界層。葉室氣流混勻風(fēng)扇的高轉(zhuǎn)速可將邊界層降至最低，確保葉室內(nèi)空氣充分混合，從而降低真實(shí)g_s值的不確定性。在使用定制葉室設(shè)置時(shí)，請使用大功率風(fēng)扇以確保葉室空氣的良好混合。值得注意的是，對于給定的VPD_leaf，室內(nèi)邊界層的減少意味著葉片比室外的葉片失水更多，如果有足夠的時(shí)間，這可能會影響g_s。因此，盡管環(huán)境條件可能相同，但葉室內(nèi)外的葉片所處的"真實(shí)環(huán)境"并不相同，。

除了對邊界層的影響外，高風(fēng)扇轉(zhuǎn)速還能促進(jìn)空氣與葉片表面以及葉室壁體之間的熱交換。當(dāng)測量溫度低于環(huán)境溫度時(shí)，低風(fēng)扇轉(zhuǎn)速可能會成為一個(gè)問題，因?yàn)闊峤粨Q受阻會導(dǎo)致葉室內(nèi)冷卻不足，進(jìn)而產(chǎn)生冷凝問題。

保持葉室清潔

葉室內(nèi)的灰塵和污垢會吸收和釋放氣體，從而干擾測量，尤其是當(dāng)腔室內(nèi)的條件快速變化時(shí)。當(dāng)異物積聚在IRGA中時(shí)，會造成信號噪音并減弱信號強(qiáng)度。小動物(如蜘蛛、薊馬)會導(dǎo)致信號出現(xiàn)不穩(wěn)定的尖峰，因此在將葉片插入葉室內(nèi)之前必須檢查葉片表面。盡量不要使用被害蟲破壞或受傷的葉片進(jìn)行測量，因?yàn)樗鼈儠�顯示出高蒸騰速率，而這并不是氣孔開度的結(jié)果。在田間測量時(shí)，確保將主機(jī)架離地面，以減少灰塵通過進(jìn)氣口進(jìn)入系統(tǒng)。

定期檢查化學(xué)藥品的性能

在開始一系列新的測量之前，必須使用新鮮的化學(xué)試劑(如堿石灰和硅膠/干燥劑)，以避免在測量過程中出現(xiàn)環(huán)境控制問題。大多數(shù)化學(xué)試劑都具有顏色指示功能，可以幫助判斷何時(shí)需要更換。在IRGA零點(diǎn)標(biāo)定時(shí)，向進(jìn)氣口吹氣有助于評估堿石灰的性能：在分析器CO₂零點(diǎn)標(biāo)定的情況下，不應(yīng)有CO₂通過氣路。

修正測量的葉面積

在某些情況下，室內(nèi)的葉片不能完全覆蓋整個(gè)測量區(qū)域，因此需要手動確定并輸入一個(gè)值。葉面積可以通過葉片在腔體內(nèi)的照片得出(如果是透明頂腔)，也可以用筆標(biāo)出墊片的位置，然后拍攝照片。然后可以使用成像軟件(如開源圖像處理軟件包ImagJ)來估算面積。對于禾本科植物的葉片來說，測出葉片在葉室兩側(cè)的寬度通常就足以根據(jù)矩形形狀估算面積。由于光合通量以面積為基礎(chǔ)，因此要盡量避免葉片面積估算的誤差。

合理選擇要測量的葉片

大多數(shù)研究都使用最新完全展開的葉片進(jìn)行測量。然而，在植物冠層內(nèi)，由于光照梯度和葉齡的不同，光合作用能力存在很大差異。因此，在選擇測量植物的葉片時(shí)必須保持一致，并考慮時(shí)間因素，如長期實(shí)驗(yàn)中的葉片老化。

應(yīng)避免的 8 個(gè)"坑"

結(jié)露/冷凝

當(dāng)葉室內(nèi)空氣的露點(diǎn)溫度接近任何系統(tǒng)組件的最低溫度(通常是葉室壁體溫度)時(shí)，就會出現(xiàn)冷凝現(xiàn)象。盡管通常無法直接看到冷凝現(xiàn)象，但它仍會導(dǎo)致光合作用測量結(jié)果無效。一旦檢測到冷凝現(xiàn)象，就需要在進(jìn)一步測量之前將機(jī)器烘干。為確保良好的濕度控制，測量前應(yīng)確保干燥劑新鮮，IRGA正確歸零。在測量過程中，我們建議相對濕度不要超過85%。通過確�？諝饴饵c(diǎn)溫度始終比葉片、空氣或測量室溫度的最低值至少低一度來控制濕度，可防止測量室內(nèi)形成高相對濕度和冷凝水。特別需要注意測量室壁的溫度，因?yàn)檫@是最有可能出現(xiàn)冷凝水的地方。在將葉片放入測量室后的幾分鐘內(nèi)要特別注意，以確保在氣孔適應(yīng)新條件時(shí)，蒸騰作用不會導(dǎo)致相對濕度過高。如果僅靠濕度控制無法維持設(shè)定濕度，需要降低濕度，則可提高葉室控制溫度和/或流速。

胞間CO₂濃度C_i負(fù)值

作為空氣中CO₂分子的摩爾分?jǐn)?shù)，C_i值應(yīng)始終為正值。如果葉室中出現(xiàn)冷凝現(xiàn)象，C_i值的計(jì)算就可能不正確，從而出現(xiàn)負(fù)值。在低[CO₂]時(shí)的CO₂響應(yīng)曲線中，發(fā)生這種情況的風(fēng)險(xiǎn)尤其大，因?yàn)榇藭r(shí)氣孔往往打開得最多。對于不能自動調(diào)節(jié)相對濕度以防止冷凝的機(jī)器，請遵循上述避免葉室內(nèi)冷凝的建議。

漏氣

漏氣的主要原因通常是通過固定葉片在測量頭上的墊圈、未接牢固的排氣管、測量頭連接點(diǎn)上損壞的O形環(huán)以及干燥劑藥品管接頭密封不嚴(yán)造成的。流量無法達(dá)到設(shè)定點(diǎn)，CO₂值波動較大，無法達(dá)到高于空氣的CO₂控制值，都可能表明存在漏氣。如果懷疑有漏氣，請進(jìn)行以下檢查(另請參見 "良好操作規(guī)范"部分)：

1.測量頭是否正確關(guān)閉，密封墊是否完好？如果老化導(dǎo)致密封不良，請更換密封墊片。

2.排氣管是否正確連接到測量頭和主機(jī)？

3.加濕劑和干燥劑管是否正確安裝就位，蓋子是否密封，空氣過濾器是否完好？

4.熱電偶是否安裝正確？

5.檢查所有O形環(huán)，更換損壞的O形環(huán)。

氣孔關(guān)閉

如果g_s過低，例如當(dāng)植物處于干旱脅迫時(shí)，則很難獲得較高的C_i值和有用的A/C_i響應(yīng)。對于這些測量，適當(dāng)調(diào)整VPD_leaf非常重要，因?yàn)檫^度蒸騰是造成氣孔關(guān)閉的主要原因：一般來說，為避免氣孔關(guān)閉，VPD_leaf不應(yīng)超過1.5千帕，同時(shí)需要確保相對濕度不超過 85%，以避免冷凝。適合大多數(shù)測量的VPD_leaf范圍約為0.8-1.2千帕。適當(dāng)?shù)腣PD_leaf水平還取決于機(jī)器是否需要加熱或冷卻葉室以達(dá)到設(shè)定的測量溫度。在前一種情況下，相對濕度為85%可能比較合適，而在后一種情況下，高的相對濕度則會導(dǎo)致冷凝。保持植物水分充足，不要在測量前溫度/濕度驟變的情況下接觸植物，這很有幫助。如果盡管如此，氣孔反應(yīng)仍然非常緩慢，請檢查光質(zhì)設(shè)置(藍(lán)光的貢獻(xiàn)率至少應(yīng)為10%，參見上文"調(diào)整光質(zhì)")。也可將葉片短暫置于低[CO₂](約100 μmol mol-1)環(huán)境中，這有助于誘導(dǎo)氣孔開放。

環(huán)境空氣與葉室之間的溫差較大

測量空氣的溫度與葉室控制溫度之間的差異過大，有可能導(dǎo)致冷凝或無法達(dá)到足夠低的VPD_leaf以確保氣孔開放。此外，由于葉片熱電偶測得的溫度會受到周圍空氣溫度的影響，因此葉室內(nèi)空氣與葉片之間較大的溫度梯度可能會導(dǎo)致T_leaf不正確。通過使所有系統(tǒng)組件盡可能接近設(shè)定的T_leaf，可將這些問題降至最低。如果要在環(huán)境條件之外空間內(nèi)進(jìn)行測量，則應(yīng)將整個(gè)氣體交換系統(tǒng)和測量頭置于氣候受控的空間內(nèi)，如生長室或培養(yǎng)箱。這樣就可以將IRGA周圍的溫度設(shè)定在接近T_leaf的范圍內(nèi)，從而最大限度地減少溫度梯度和冷凝現(xiàn)象，并擴(kuò)大測量的溫度范圍。

熱電偶接觸葉片的位置

葉片熱電偶必須正確安裝，并在測量時(shí)接觸葉片背面。如果不接觸葉片，熱電偶將測量葉室內(nèi)的空氣溫度。如果推得太遠(yuǎn)，可能會撕裂葉片并弄彎熱電偶。對于較大的葉室，單個(gè)熱電偶可能不足以捕捉整個(gè)葉片的異質(zhì)性，如果可以，請使用第二個(gè)熱電偶。計(jì)算g_s和C_i等許多參數(shù)都需要精確測量葉片溫度，熱電偶位置不正確或損壞會導(dǎo)致曲線擬合中光合作用能力的估算不正確。在無法接觸葉面的情況下，可采用能量平衡法估算參數(shù)。

晝夜節(jié)律效應(yīng)

許多物種以晝夜為周期進(jìn)行光合作用，有些物種由于氣孔關(guān)閉或在高溫和強(qiáng)光條件下光保護(hù)或光抑制作用增強(qiáng)，中午光合作用明顯減弱。在比較不同樣品的光合作用能力時(shí)，應(yīng)確保在g_s不會過度限制光合作用時(shí)(即氣孔基本開放時(shí))進(jìn)行測量。事先觀察相關(guān)物種g_s的晝夜變化規(guī)律，在一天中進(jìn)行多組調(diào)查測量，有助于確定一天中什么時(shí)間最適合進(jìn)行測量。

測量原位葉片與離體葉片

最好測量原位葉片，因?yàn)榧羟腥~片會導(dǎo)致葉片水勢迅速發(fā)生變化，從而影響蒸騰和氣孔導(dǎo)度反應(yīng)。對于特定處理(如施用激素)或由于樣品本身的特性限制(如大樹冠層的葉片)，可使用離體的葉片進(jìn)行測量，但應(yīng)注意對此類結(jié)果的解釋，尤其是那些依賴于g_s的結(jié)果。

重要提醒
原文頁面的補(bǔ)充材料里有光合作用氣體交換測量的實(shí)驗(yàn)流程，包含一般調(diào)查測量，A/C_i曲線(CO₂響應(yīng)曲線)，A/I_inc曲線(光響應(yīng)曲線) ，A/T曲線(溫度響應(yīng)曲線) ，Laisk方法測量光照下葉片的表觀呼吸速率和無呼吸作用時(shí)的細(xì)胞間CO₂補(bǔ)償點(diǎn)， Kok方法測量 光照下葉片的表觀呼吸速率R_light以及其他常用光合作用氣體交換測量方法的流程。
 

由于相關(guān)文章內(nèi)容非常專業(yè)，難免有些理解不準(zhǔn)確或者編輯整理的疏漏。另外，本翻譯稿省略了文中的參考文獻(xiàn)、擴(kuò)展閱讀、縮寫注釋。因此強(qiáng)烈建議感興趣的老師和同學(xué)閱讀原文(OA)。
 

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