熒光蛋白及其光譜特性
來自 A. 維多利亞州的熒光蛋白
什么是綠色熒光蛋白（GFP）？
GFP（綠色熒光蛋白）或其變體的光譜特性取決于構(gòu)成發(fā)色團的氨基酸結(jié)構(gòu)（圖 1）[2]。這可能是位于 65-67 位的三個氨基酸或靠近該位置的殘基（如 YFP）。除了有關(guān)發(fā)色團的主要突變外，還進行了其他定點誘變研究，以改善蛋白質(zhì)成熟和在異源細胞系統(tǒng)中表達等其他因素（如密碼子使用、蛋白質(zhì)在生理溫度下的折疊）。請注意，維多利亞甲蟲是一種相對原始的外溫海洋生物，沒有調(diào)節(jié)體溫的生理系統(tǒng)。
圖 1：GFP 的分子結(jié)構(gòu)。
盡管 GFP 因其亮度和高光穩(wěn)定性而成為最受歡迎的熒光粉之一，但它也有兩個主要缺點：對 pH 值有一定的敏感性和輕微的二聚傾向。二聚化或寡聚化是許多 FP 的一個問題。它們相互凝集的傾向會產(chǎn)生假象或誤解融合蛋白的位置和功能。不過，科學(xué)家們也找到了一些解決這一問題的辦法。在關(guān)鍵位置（F223R、L221K 和 A206K）的非極性氨基酸被親水性氨基酸取代后，二聚化程度降低[3]。所有能改善光譜和實際特性的基因改變都被歸納為"增強型"FP。
就 wtGFP 而言，增強后的 EGFP（增強型 GFP）在 488 納米波長處只有一個激發(fā)峰，而不是以前在 395 納米波長和 475 納米波長處的復(fù)雜吸收光譜[2,3]。Roger Heim、Douglas Prasher 和 Roger Tsien 開發(fā)的第一種 wtGFP 突變體（S65T 突變體）的亮度是原來的五倍，而且成熟時間更短[3]。加上另一個突變體（F64L）在 37°C 溫度下的成熟效率更高，這對于觀察活細胞的人來說具有重要作用。
藍寶石（Sapphire）[3]是一個非常有趣的 GFP 變體，它的斯托克斯位移最大�？拷l(fā)色團的一個位置發(fā)生了突變（T203I），導(dǎo)致激發(fā)最大值變?yōu)?399 納米，發(fā)射最大值變?yōu)?511 納米。這就是 112 納米的斯托克斯偏移。Emerald 是另一種 GFP 改造品，它能提高光穩(wěn)定性和亮度，并能在哺乳動物細胞中更有效地折疊[3]。
所有綠色熒光蛋白都具有相對較高的亮度，而藍色熒光蛋白在顯微應(yīng)用中通常會降低發(fā)射強度。盡管如此，由于具有其他光譜特性，它們?nèi)员挥糜诠鈱W(xué)檢測。EBFP（增強型藍色熒光蛋白）是通過對 wtGFP 進行幾輪突變而構(gòu)建的[3]。第一個突變（Y66H）使發(fā)射峰從綠色變?yōu)樗{色。隨后更多的突變產(chǎn)生了一種激發(fā)最大波長為 380 納米、發(fā)射最大波長為 448 納米的蛋白質(zhì)。這些光譜特性使其成為 EGFP 在 FRET 顯微鏡下的搭檔。最近，Azurite，SBFP2和 EBFP2 等藍色熒光蛋白具有更高的量子產(chǎn)率和更好的光穩(wěn)定性[3]。EBFP 的后繼者是一種名為 Sirius 的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)對 pH 值的耐受性非常高（在 pH 值 3 到 9 之間都很穩(wěn)定），而且是迄今為止發(fā)射波長最短的熒光蛋白，因此很受歡迎[3]。
第二類 "藍色" GFP 變體是由青色熒光蛋白 (CFPs)形成的[3]。用色氨酸取代酪氨酸（Y66W）并進一步改變基因，可產(chǎn)生亮度和光穩(wěn)定性更好的熒光色素。這種 ECFP 在 433/445 納米和 475/503 納米具有雙峰激發(fā)和發(fā)射光譜。亮度僅為 EGFP 的 40%。Cerulean 是 ECFP 的一個重要變體，它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率 [3]。它的亮度是 ECFP 的 1.5 倍，被用作 YFP 的 FRET 伴侶。
GFP 的突變并不直接改變發(fā)色團三個中心氨基酸中的一個，因此出現(xiàn)了黃色熒光蛋白（YFP）[3]。YFP 在 203 位有一個共同的蘇氨酸，該位置被一個酪氨酸（T203Y）取代。該氨基酸是 β 管的一部分，靠近發(fā)色團。與 GFP 相比，EYFP 的激發(fā)和發(fā)射特性已轉(zhuǎn)向更長的波長，其激發(fā)和發(fā)射最大值分別為 514 納米和 527 納米（EYFP）。EYFP 的一個特點是對 pH 值敏感。在 pH 值為 6.5 時，EYFP 只有約 50%的熒光，但這并不總是一個缺點。在測量 pH 值（如囊泡、內(nèi)體等）時，EYFP 可用作指示劑。有趣的是，進一步的突變（Q69M）產(chǎn)生了更好的酸穩(wěn)定性并顯著提高了亮度（比 EGFP 亮 75%）。與 EGFP 相比，這種蛋白質(zhì)的光穩(wěn)定性仍然較差，因此被稱為Citrine [3]。另一種 YFP 突變體（F46L）的成熟速度大大加快，耐酸堿性也有所提高。這種蛋白質(zhì)被命名為 Venus，是 Cerulean 的一種常見 FRET 受體 [3]。
如上圖所示，來自維多利亞水母的大多數(shù)熒光蛋白發(fā)出的光譜為藍色至黃色。紅色熒光蛋白則不見蹤影。俄羅斯科學(xué)家謝爾蓋-盧基揚諾夫（Sergey Lukyanov）發(fā)現(xiàn)了擬水螅中的熒光蛋白，填補了這一空白[4]。與其他熒光蛋白相比，紅色熒光蛋白（RFPs）具有很大的優(yōu)勢，因為在光譜的紅色部分，細胞中的自發(fā)熒光要少得多[3]。此外，它們能被較長的波長激發(fā)，這對活細胞更有利，因為較短波長的光對標本的損害更大。與水母蛋白相比，珊瑚蛋白的另一個普遍優(yōu)勢是它們能在 37°C 溫度下高效成熟。維多利亞A. GFP及其衍生物必須經(jīng)過基因改造才能以正確的方式折疊，而動物蛋白的成熟則無需分子工程。這可能是由于其生物群落的水溫較高。
在擬水生動物中發(fā)現(xiàn)的第一種 FPs，也是目前使用最多的 FPs 之一是 DsRed[3]。其名稱來源于海葵 Discosoma striata。DsRed 的激發(fā)最大波長為 558 nm，發(fā)射峰值為 583 nm。然而，當(dāng)其結(jié)構(gòu)信息公布后，最初的興奮就停滯不前了。DsRed 的成熟速度比水母 FP 慢得多，并且有一個中間發(fā)色團階段。這一階段發(fā)出的光為綠色光譜，會與其他 FP 重疊。GFP 部分已經(jīng)提到，DsRed 還有另一個問題。�？t色熒光蛋白是一種強制性四聚體，容易形成寡聚體。這可能導(dǎo)致對融合蛋白的位置和功能產(chǎn)生誤解。一般來說，安氏無脊椎動物的 FPs 與維多利亞無脊椎動物的 FPs 具有相似的結(jié)構(gòu)。發(fā)色團隱藏在大小為 4 nm x 3 nm（高 x 直徑）的 β 管狀結(jié)構(gòu)中。不同之處在于安氏囊蟲的 β-桶狀結(jié)構(gòu)更像橢圓形（圖 2）。
在 GFP "進化" 的同時，研究人員開始對原始 DsRed 進行改造，以克服其結(jié)構(gòu)缺陷。第二代 DsRed--DsRed2--減少了寡聚體的形成趨勢，加快了成熟速度，最大限度地減少了綠色發(fā)光的中間階段[3]。進一步的誘變導(dǎo)致紅色 FP 完全失去了四聚體狀態(tài)，但也喪失了部分量子產(chǎn)率（DsRed2 的 25%）。錢氏實驗室的這項工作產(chǎn)生了第一個單體紅色熒光蛋白，因此他們稱之為 mRFP1 [3]。
隨后，以這種 mRFP1 為起點，產(chǎn)生了一組六種單體 FP，統(tǒng)稱為 "mFruit" [3]。它們各自的名稱源自其發(fā)射顏色：mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。mCherry 是這些 FPs 中最有用的一種，它在 610 納米范圍內(nèi)發(fā)光，亮度是 EGFP 的 50%。
迄今為止最耀眼的 FP 是 mFruit 派系的追隨者，名為 tdTomato [3]。在基因改變之前，dTomato 是一種強制性二聚體，但通過將兩個二聚化伙伴放在一個分子中，避免了二聚化。兩個 dTomato 單元通過 12 個氨基酸連接體耦合，形成串聯(lián)二聚體 FP tdTomato，其發(fā)射最大值為 581 納米，在光譜的最高區(qū)域具有光穩(wěn)定性。
mPlum是所有 mFruit 蛋白中紅色發(fā)射最深的一種，發(fā)射波長為 649 nm [3]。
圖 2：DsRed 熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)。
科學(xué)上使用的綠色熒光類動物蛋白數(shù)量非常少，這并不令人驚訝，因為我們已經(jīng)有了眾所周知，使用方便的維多利亞蟲 GFP。顯然，沒有人認為有必要建立一種新的綠色熒光蛋白。盡管如此，還是有一些新的綠色熒光蛋白出現(xiàn)了，比如石珊瑚中的一種明亮熒光蛋白--Azami Green [3]。有趣的是，它與 EGFP 的序列同源性不到 6%。
Katushka 是一種對深部組織成像具有重大影響的擬態(tài)熒光蛋白 [3]。通過對來自 E. quadricolor 的 RFPs 進行誘變，發(fā)現(xiàn) Katushka 是一種二聚體蛋白，在 635 納米波長處具有最大發(fā)射亮度，是所有深紅色熒光蛋白中亮度最高的。Katushka的單體形式被稱為 mKate，后來被提供了更高亮度的 mKate2 [3]。
總之，今天用于顯微應(yīng)用的所有熒光蛋白都來自原始海洋生物。表 1 列出了最重要的熒光蛋白及其相關(guān)光譜特性，如激發(fā)和發(fā)射最大值、光穩(wěn)定性、量子產(chǎn)率和亮度。
展 望
一個非常有趣的故事是，人們發(fā)現(xiàn)了一種由脊椎動物表達的 FP。文昌魚（Amphioxus）是一種小型魚類海洋脊索動物，在其前端產(chǎn)生AmphiGFP [3]。對該 FP 的序列分析表明，它具有典型的 β-桶狀結(jié)構(gòu)，似乎與橈足類 Pontellina plumata（甲殼動物）的 CopGFP有關(guān) [5]。這一發(fā)現(xiàn)表明，熒光現(xiàn)象并不局限于原始無脊椎動物，在更高進化階段的動物中也能發(fā)現(xiàn)。此外，這一發(fā)現(xiàn)還表明，熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、改造和增強過程仍在繼續(xù)，這也是目前的熱門研究課題。這一事實證明了熒光蛋白對當(dāng)前和未來生命科學(xué)研究的重要性和巨大影響。
熒光蛋白質(zhì)的光譜特性
- Ex：峰值激發(fā)波長（納米）
- Em：峰值發(fā)射波長（納米）
- MW：分子量 QY：量子產(chǎn)率
- BR：亮度；
- 消光系數(shù) * 量子產(chǎn)率/1,000
- PS：光穩(wěn)定性；亮度達到 50%的時間（秒）
表 1：熒光蛋白的光譜特性 (數(shù)據(jù)來源為參與文獻 6)。
相關(guān)產(chǎn)品
DMi 8高端倒置顯微鏡平臺
STELLARIS 5 & STELLARIS 8 共聚焦顯微鏡平臺
MICA全場景顯微成像分析平臺
參考文獻：（上下滑動查看更多）
1.O. Shimomura, Discovery of Green Fluorescent Protein, GFP, Nobel Lecture, Nobel Prize in Chemistry 2008 (Nobel Foundation, December 8, 2008).
2.G.-J. Kremers, S.G. Gilbert, P.J. Cranfill, M.W. Davidson, D.W. Piston, Fluorescent proteins at a glance, J. Cell Sci. (2011) vol. 124, iss. 2, pp. 157-160, DOI: 10.1242/jcs.072744.
3.R.N. Day, M.W. Davidson, The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging, Chem. Soc. Rev. (2009) vo. 38, iss. 10, pp. 2887-2921, DOI: 10.1039/b901966a.
4.C. Greb, Fluorescent Proteins - From the Beginnings to the Nobel Prize, Science Lab (2012) Leica Microsystems.
5.D. A. Shagin, E.V. Barsova, Y.G. Yanushevich, A.F. Fradkov, K.A. Lukyanov, Y.A. Labas, T.N. Semenova, J.A. Ugalde, A. Meyers, J.M. Nunez, E.A. Widder, S.A. Lukyanov, M.V. Matz, GFP-like Proteins as Ubiquitous Metazoan Superfamily: Evolution of Functional Features and Structural Complexity, Molecular Biology and Evolution (2004) vol. 21, iss. 5, pp. 841-850, DOI: 10.1093/molbev/msh079.
6.Fluorescent Proteins, Table of Fluorochromes, Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California, USA.
