空間多組學技術，是近年來逐漸興起的分子組學研究技術，與傳統(tǒng)的組學技術相比，在檢測基因、蛋白質、代謝物表達水平的同時，獲得其空間位置信息。此外，將這些數(shù)據(jù)結果與病理圖像信息相結合，便可探究疾病發(fā)展過程中重要區(qū)域內的分子表達、細胞分布及信號通路的變化特征。2022年，Nature Methods將空間多組學技術評為年度技術，足見其在生物學研究中發(fā)揮的重要作用。因此，為了讓大家能掌握空間多組學的研究思路，小編帶來了一篇Matthias Mann教授團隊的文章，以空間蛋白質組+空間轉錄組為例，看空間多組學技術如何應用于腫瘤新療法的開發(fā)工作。

文章題目：Spatial proteo-transcriptomic profiling reveals the molecular landscape of borderline ovarian tumors and their invasive progression
中文題目：空間蛋白質轉錄圖譜揭示交界性卵巢癌及其侵襲性進展的分子特征
發(fā)表時間：2023.11.13
期刊名稱：medRxiv
影響因子：無
實驗平臺：LCM+timsTOF SCP+GeoMx DSP
DOI：10.1101/2023.11.13.23298409

研究背景 

漿液性交界性腫瘤(SBT)是卵巢的上皮性腫瘤性病變，通常預后良好。然而，在10-15%的病例中，SBT會復發(fā)為低級別漿液性癌(LGSC)，這種腫瘤具有很深的侵襲性，對當前標準的化療方案應答很差。雖然基因改變表明有共同的起源，但從SBT到LGSC的轉變仍然難以理解。因此，本研究借助空間蛋白質組和空間轉錄組的力量，探究SBT向LGSC的侵襲性轉化過程中蛋白質/轉錄本表達及信號通路的變化信息，尋找更有效的治療方法。

技術路線  

為了方便各位老師快速掌握研究思路和結果，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。
 

組織類型：患者組織切片，包括SBT、微乳頭狀SBT（SBT-MP）、原發(fā)LGSC（LGSC-PT）和轉移LGSC（LGSC-Met）四個疾病階段的樣品。

空間蛋白質組（DVP）檢測方法：使用 nucleAIzer AI算法在切片上分割細胞群，并結合激光捕獲顯微切割技術（LCM）和高靈敏度的4D質譜儀timsTOF進行切割捕獲和蛋白質組分析。

空間轉錄組（DSP）檢測方法：使用GeoMx DSP技術分析切片中感興趣區(qū)域（ROI）的轉錄組信息。

研究結果 

1.  DVP 揭示交界性腫瘤向LGSC-Met的進展

對上皮組織空間蛋白質組學結果進行PCA分析發(fā)現(xiàn)四種階段的腫瘤組織能夠有序的聚類，并且微乳頭狀生長是非侵襲性SBT和侵襲性低級別腫瘤的中間階段。線性回歸分析，確定了在侵襲性表型中195個蛋白質的上調和下調，代表了從SBT到LGSC及相應癌轉移的轉變過程。具有微乳頭狀特征的SBT作為LGSC復發(fā)的風險較高。然而，關于SBT-MP是否是LGSC的前體存在爭議。DVP數(shù)據(jù)表明，SBT-MP和SBT的蛋白質表達在代謝方面發(fā)生顯著變化，AHDC1 和 ERF以及與腫瘤干性相關的蛋白質在SBT-MP中上調，而腫瘤抑制因子則下調。整體而言，SBT-MP的蛋白質表達更類似于SBT，但在多個方面反映了惡性轉化的特征。MAPK信號通路在LGSC和SBT中發(fā)生了改變，ERK1/2和Met信號在LGSC中富集。此外，TGF-β信號通路下游的多個蛋白質在SBT-MP或LGSC中逐漸上調。大多數(shù)SBT和LGSC表達激素受體，在抗激素治療上具有暫時的響應性。從SBT到SBT-MP時孕激素結合蛋白PGRMC2逐漸增加，表明孕激素在早期向LGSC過渡過程中發(fā)揮作用。此外，一些蛋白質的表達隨著階段發(fā)展發(fā)生變化，如PAX8、CAPS等，在SBT中表達，但在LGSC中逐漸喪失，NOVA2在LGSC中表達，但在SBT和SBT-MP中不表達。
 

Fig.1 腫瘤上皮區(qū)的空間蛋白質組分析鑒定SBT向LGSC轉變的新途徑

2. 腫瘤微環(huán)境的空間蛋白質組學分析

在基質細胞中，從SBT到LGSC過程中，發(fā)現(xiàn)178種蛋白質顯著變化。PCA分析表明SBT和SBT-MP的蛋白質表達譜與LGSC及其相應的轉移存在明顯區(qū)別，與上皮區(qū)域不同，SBT和SBT-MP的基質非常相似，沒有向LGSC過渡的中間進展。在SBT向LGSC轉變過程中，與腫瘤增殖和EMT相關的蛋白表達發(fā)生變化。這些表達變化伴隨著ECM重塑蛋白的顯著變化，表明了密集的腫瘤微環(huán)境。LGSC-PT中細胞動態(tài)相關的生物學過程上調，與ephrin信號通路相關。基質從非侵襲性到侵襲性腫瘤階段的過渡伴隨著葡萄糖代謝的增加，以及NNMT等蛋白的上調，這些蛋白在侵襲性LGSC中高表達。
 

Fig.2 腫瘤基質區(qū)的空間蛋白質組分析揭示SBT向LGSC轉變的雙向性

3. SBT向侵襲性LGSC進展過程中空間轉錄組的特征變化

蛋白質表達最能反映細胞的功能表型，然而，將蛋白質與轉錄組變化聯(lián)系起來能更好地理解LGSC的生物學特征，提供腫瘤細胞和周圍基質細胞的通訊信息，識別只用一種組學分析手段可能錯過的治療靶點。使用GeoMx DSP技術，對ROI的轉錄組進行檢測。在上皮中，發(fā)現(xiàn)1,386個轉錄本在SBT和LGSC-PT之間有差異表達。在SBT中，AGR2和MUC5B等基因上調，而在LGSC中則上調了CA-125結合伙伴MSLN和絲氨酸蛋白酶KLK6等基因。有趣的是，在LGSC-PT中，幾個在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達的基因轉錄本，如SPOCK2和SNCG被上調。在蛋白質組學數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)在SBT到SBT-MP的早期轉變過程中，SNCG蛋白上調。GSEA分析發(fā)現(xiàn)粘蛋白編碼基因表達水平、組織遷移、信號素通路和對EGF的應答發(fā)生變化。RTK受體c-Met及其下游效應子在LGSC和LGSC-Met中顯著增加，與空間蛋白質組學結果一致。PCA分析表明上皮中SBT和SBT-MP的差異，基質基因表達明顯區(qū)分了SBT/SBT-MP和LGSC-PT/LGSC-Met。已知的基質轉錄本，如S100A10、C3和NNMT，與空間蛋白質組學結果相一致。在CAFs中，上調的通路包括的基因與血管生成和缺氧有關。
 

Fig.3 SBT和LGSC的空間轉錄組結果

4. 整合空間轉錄組和空間蛋白質組

整合空間蛋白質組、空間轉錄組和HE染色結果，可能在理解腫瘤器官時相互補充。特別是，蛋白質和轉錄本表達的整合能夠揭示轉錄和翻譯之間復雜的相互作用。在上皮和基質中，DVP和DSP之間有部分重疊的蛋白質和轉錄本，但差異表達的蛋白質和轉錄本重疊很少。這些結果表明兩種技術可檢測到的基因產物和生物調控方面的差異。因此，研究者將兩種技術均定量檢測到的基因用于下游分析，分別從上皮和基質中選擇了兩種技術檢測到的最相關的蛋白質/轉錄本，并從下調表達結果中篩選出70個存在于腫瘤抑制因子數(shù)據(jù)庫的靶點基因，結合文獻綜述注釋其生物學相關性。這其中多個蛋白質都是臨床批準或臨床前抑制劑的靶點，如CCN2、ANXA2、ADAM15等。
 

Fig.4 整合空間蛋白質組和空間轉錄組

5. 驗證實驗表征SBT向LGSC的轉變過程

在描繪了從SBT到LGSC-met轉變的蛋白質組和轉錄組圖譜后，對幾種LGSC細胞系進行質譜檢測，并將其與空間蛋白質組學獲取的上皮區(qū)域數(shù)據(jù)進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)這些細胞系與SBT和LGSC-PT上皮中的蛋白質組學結果呈正相關。使用 VOA4627 LGSC 細胞系進行 siRNA 篩選，揭示了ADAM15、CLIC3、NOVA2、POSTN和SNCG等基因對細胞遷移的關鍵作用。對FDA批準的抑制劑進行測試顯示，c-MET、EGFR和CDK抑制劑抑制了LGSC細胞系的增殖和侵襲，而FOLR1-抗體藥物結合物僅抑制了細胞增殖。NNMT在LGSC中是最顯著上調的基質驅動因子，在體內模型中，NNMT抑制劑減緩了LGSC細胞的皮下腫瘤生長。總體而言，從空間蛋白質組學和轉錄組學結果中預測關鍵通路和靶點，并使用FDA批準的抑制劑進行功能驗證的思路，在研究LGSC進展時有關鍵作用。
 

Fig.5 SBT向LGSC轉變過程中重要的“組學”基因和通路的功能研究

 
主要結論 

本研究利用空間蛋白質組和空間轉錄組技術闡明從SBT到LGSC及癌轉移的演變過程中腫瘤和基質分子水平的變化特征。從SBT到LGSC的過渡發(fā)生在上皮組織中，經(jīng)過具有微小乳頭特征的中間階段（SBT-MP），其中涉及MAPK信號逐漸增加。一組獨特的蛋白質和轉錄本與向侵襲性腫瘤生長的過渡相關，包括在LGSC及其相應的轉移中表達的神經(jīng)剪接因子NOVA2。通路分析揭示了腫瘤細胞的異常分子信號傳導，受到腫瘤微環(huán)境中血管生成和炎癥變化的支持。隨后通過敲除改變最大的基因或對最相關的靶點進行藥物抑制，證實了它們在調控侵襲性的關鍵特征方面的功能重要性。結合細胞類型分辨的空間蛋白質組學和轉錄組學，使我們能夠闡明從SBT到LGSC的腫瘤發(fā)生序列。這里提出的方法是系統(tǒng)闡明腫瘤發(fā)生機制和發(fā)現(xiàn)新治療策略的藍圖。

參考文獻： 

Schweizer, Lisa et al. “Spatial proteo-transcriptomic profiling reveals the molecular landscape of borderline ovarian tumors and their invasive progression.” medRxiv 2023.11.13.23298409.