免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)蛋白定位，定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類(lèi)，組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。

石蠟切片，對(duì)組織形態(tài)保存好，保存時(shí)間也長(zhǎng)，雖然對(duì)組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復(fù)，所以石蠟切片仍然是首選的標(biāo)本制作方法。

一、免疫組化操作步驟：

1、在60°烤箱烤片30~60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)郭的人員切片，片子的厚薄均勻，切片的完整，無(wú)褶無(wú)刀痕。

2、脫蠟水化，依次放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低）各2min，水。然后用自來(lái)水洗一下，但不要直接對(duì)著切片沖洗。

3、抗原修復(fù)，小編用的是高壓熱修復(fù)，ph6.0的檸檬酸鹽緩沖液，一定要全部浸泡切片，等高壓鍋冒氣后5min結(jié)束，自然冷卻，溫度劇降可能引起脫片哦。3%H202避光浸泡15min。

4、用免疫組化油筆圍繞組織畫(huà)圈，接下來(lái)就能看見(jiàn)它的功效了。PBS洗5min*3次。PBS會(huì)被鎖在畫(huà)的圈中，不會(huì)流干，保證不干片。

二、問(wèn)題分析：

1、免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？

實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類(lèi)，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀(guān)察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。

2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？

石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。

3、免疫組化常用的染色方法有哪些？

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

4、石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度； 

2）用含有多聚賴(lài)氨酸的玻片，可以購(gòu)買(mǎi)到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織； 

4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。 

5、邊緣效應(yīng)

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴(lài)氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。 

6、產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條； 

2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看； 

3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色； 

4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果； 

5）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高； 

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要； 

7）標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。 

7、免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1）抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤；   

2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)； 

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

5）DAB孵育時(shí)間過(guò)短；

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7）開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。 

8、背景

1）考慮一抗?jié)舛雀撸?br />
2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；

3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；

4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。