研究背景：
心房顫動（AF）是最常見的心律失常疾病，最近研究闡明了心房心肌病（ACM）是房顫發(fā)生的原因之一，進(jìn)而造成心房血栓形成和卒中。然而，心房病變復(fù)雜而持久的致病過程僅被實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒糠謴?fù)制，其潛在的分子行為和信號通路仍知之甚少。

 

大型動物（山羊、豬和狗等）是房顫研究的重要模型，這些模型構(gòu)建通常是快速心房起搏或人工誘導(dǎo)二尖瓣功能不全，成功率較低、花費(fèi)較高，而鼠的模型構(gòu)建更節(jié)省成本。但小鼠在沒有程序化電刺激的情況下通常不會發(fā)生房顫，具有自發(fā)性房顫的模型需要基因修飾來誘導(dǎo)穩(wěn)定和可遺傳的重構(gòu)。

 

啟動子中的cAMP響應(yīng)元件（CRE）與cAMP響應(yīng)元件蛋白（CREB）和cAMP響應(yīng)元件調(diào)節(jié)器（CREM）作為二聚體結(jié)合，該二聚體控制下游信號分子的活性，參與轉(zhuǎn)錄信號通路。CREM的一種IbΔC-X亞型，Muller教授等人利用TALEN系統(tǒng)開發(fā)了一個表達(dá)CREMIbΔC-X的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。這些轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出包括心房增大、自發(fā)性房顫和左心室肥厚等心臟表型。功能分析顯示該模型中心房纖維化、傳導(dǎo)系統(tǒng)受損、肌漿網(wǎng)Ca²⁺滲漏增加。因此，CREM-IbΔC-X是一個合適的靶基因，具有廣泛調(diào)控功能參與發(fā)病機(jī)制。

 

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種簡單、快速的工具，它可以有效地修飾不同物種和細(xì)胞類型的內(nèi)源性基因。本研究的目的是利用CRISPR/Cas9技術(shù)生成心臟特異性的CREM-IbΔC-X轉(zhuǎn)基因小鼠（稱為CS-CREM小鼠）。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
房顫患者心房組織中CREM-IbΔC-X的表達(dá)增加
 

CREM-IbΔC-X是CREM轉(zhuǎn)錄因子的一種亞型，是cAMP信號傳導(dǎo)的抑制因子。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，CREM/ATF1家族靶基因的下調(diào)與人類AF易感性相關(guān)。為了進(jìn)一步研究CREM-IbΔC-X在房顫患者中的表達(dá)水平，獲取了竇性心律患者和房顫患者的心房組織。

 

首先進(jìn)行免疫熒光染色，檢測panCREM蛋白的表達(dá)（圖1A）。結(jié)果表明，房顫患者心房樣本中泛CREM蛋白的表達(dá)普遍較高。同時檢測CREM蛋白及其亞型的表達(dá)（圖1B）。結(jié)果一致顯示，與野生型CREM蛋白及其亞型對應(yīng)的3條主要條帶（~37、30和20 kDa）在AF組中更為明顯。使用qPCR評估了CREM-IbΔC-X亞型的mRNA水平（圖1C）。結(jié)果顯示，在房顫患者的心房標(biāo)本中，CREM-IbΔC-X亞型的表達(dá)明顯增加。

Figure 1.房顫患者心房樣本中CREM-IbΔC-X蛋白表達(dá)的驗(yàn)證
 

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CS-CREM小鼠
 

在本研究中，作者使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠（稱為CS-CREM小鼠）中誘導(dǎo)心臟特異性的CREM-IbΔC-X過表達(dá)。

 

靶向策略如圖2A所示，通過CRISPR/Cas9基因編輯，將靶基因成功整合到小鼠H11染色體中。對三種高危sgrna進(jìn)行了可能的脫靶效應(yīng)試驗(yàn)，研究表明在CS-CREM小鼠中脫靶效應(yīng)和隨機(jī)插入CREM-IbΔC-X在C-CREM小鼠中是不可見的。  

 

野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出相同的外觀和大小（圖2B）。為了鑒定小鼠的基因型，作者使用特異性引物序列擴(kuò)增DNA，野生型（412 bp）和靶向小鼠（307 bp）產(chǎn)生不同的條帶，如圖2C所示。

 

生存分析顯示，純合子小鼠的壽命不到一個月；雜合子小鼠與野生型小鼠之間的生存曲線無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05，圖2D）。5只產(chǎn)后雜合子雌性小鼠中有4只在出生后死亡，高于平均死亡率。可能懷孕增加了心臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致心力衰竭、產(chǎn)后死亡。因此，將雄性雜合子小鼠與雌性野生型小鼠交配，產(chǎn)生雜合子后代，同時驗(yàn)證了雜合子小鼠的CREM-IbΔC-X基因在子代中穩(wěn)定表達(dá)。

Figure 2. 靶向插入CREM-IbΔC-X并生成CS-CREM小鼠
 

CS-CREM小鼠的心房電生理重構(gòu)

本研究的重點(diǎn)主要是雜合子小鼠和野生型小鼠之間的差異。心電圖顯示，與野生型小鼠相比，雜合子小鼠的p波振幅明顯降低，而p波持續(xù)時間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3B-C）。在12周齡時，與野生型小鼠相比，雜合子動物的心房早搏負(fù)荷顯著增加（P = 0.0128，圖3D）。此外，在8周齡時，1只雜合子小鼠在常規(guī)心電圖檢查中發(fā)生了房顫，在16周時發(fā)生房顫的概率為20%（9/41）。隨著小鼠年齡的增長，雜合子CS-CREM小鼠中AF的患病率增加。到28周時，60%（25/41）的雜合子小鼠發(fā)生了AF。log-rank 13檢驗(yàn)顯示，兩條無AF生存曲線之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.0001，圖3E）。

 

為了進(jìn)一步探索CS-CREM動物自發(fā)性房顫的電生理特性，作者對20周齡野生型（wt）和雜合子（ki/wt）小鼠的心房進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，ki/wt小鼠的心房表現(xiàn)出不均勻的電傳導(dǎo)，如自發(fā)節(jié)律和8Hz起搏下的折返（圖3F）。傳導(dǎo)速度的計(jì)算表明，ki/wt小鼠心房電傳導(dǎo)速度明顯低于年齡匹配的野生型小鼠自發(fā)（0.90 ± 0.046mm/s vs. 1.27 ± 0.22mm/s，P = 0.0459）和8Hz（0.71 ± 0.024 mm/s與1.10 ± 0.23mm/s，P = 0.0392）（圖3G-H）伴隨心房有效不應(yīng)期的顯著延長（圖3I，42.733 ± 5.93 ms與30.83 ± 1.04 ms，P = 0.0268）。

Figure 3. CS-CREM小鼠的心房電生理重構(gòu)
 

CS-CREM小鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)
 

考慮到心房病變可形成房顫的底物，作者利用超聲心動圖和Masson染色對CS-CREM小鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。分別在出生后12周、20周和28周進(jìn)行超聲心動圖檢查。在后兩個時間點(diǎn)，與年齡匹配的野生型對照組相比，雜合子CSCREM小鼠顯示出明顯的心房增大。12周后，野生型小鼠的心房大小并不隨年齡的增長而增加。然而，雜合子CS-CREM小鼠的心房大小隨著時間的推移逐漸增大（12周vs. 28周，P=為0.0266）。

 

在同一時間點(diǎn)進(jìn)行Masson染色，以評估CS-CREM和野生型對照小鼠的心房纖維化（圖4A）。雜合子與野生型對照組相比，年齡匹配的CS-CREM小鼠表現(xiàn)出心房纖維化顯著增加。此外，雜合子和野生型小鼠在12周和28周之間均表現(xiàn)出心房纖維化的增加趨勢，但只有雜合子小鼠具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.0001，圖4D）。與心房重構(gòu)相反，心室纖維化沒有顯著性差異，從12-28周，雜合子CS-CREM小鼠的射血分?jǐn)?shù)在50%左右波動，但保持不變。本研究結(jié)果提示，衰老可能會促進(jìn)CS-CREM小鼠的心房纖維化并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Figure 4. CS-CREM小鼠的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)
 

CS-CREM小鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

為了探討CS-CREM小鼠心房病變的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。收集28周齡雜合子小鼠（ki/wt，n = 4）和野生型小鼠（wt，n = 4）的心房樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，共表達(dá)了786個不同的蛋白，其中365個蛋白顯著上調(diào)，421個蛋白顯著下調(diào)（P值0.05，foldvhange1.5）。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，與年齡匹配的野生型小鼠相比，CS-CREM小鼠中Myl4和Nppa表達(dá)下調(diào)。對CS-CREM小鼠中上調(diào)基因的分析顯示，與病灶粘附和血小板活化相關(guān)的基因強(qiáng)烈富集（圖5C）。下調(diào)基因的富集圖譜顯示，在CS-CREM小鼠中，有多種受影響的代謝過程，特別是脂肪酸降解和氧化磷酸化代謝（圖5D），這與使用來自ACM患者的心房樣本進(jìn)行的寶貴的蛋白質(zhì)組學(xué)研究一致。通過ChIP-qPCR進(jìn)一步探索了CREM-IbΔC-X可調(diào)控的下游基因，發(fā)現(xiàn)CREM-IbΔC-X在Myl4和Nppa的啟動子區(qū)域顯著富集（圖5E-F）。

Figure 5.CS-CREM和野生型對照小鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
 

CS-CREM小鼠的藥物反應(yīng)

為了評估CS-CREM小鼠模型中對抗心律失常藥物的反應(yīng)，作者使用了胺碘酮（III類）和普羅帕酮（Ic類），參考之前關(guān)于動物干預(yù)藥物劑量的研究。房顫小鼠尾靜脈注射5 mg/kg胺碘酮，如圖6A所示，胺碘酮有效地為所有模型終止了房顫的發(fā)作（5/5），并恢復(fù)了持續(xù)至少5分鐘的竇性心律（圖6C-D)。同樣，1.5 mg/kg的普羅帕酮（圖6B）也成功地終止了CS-CREM小鼠中AF的發(fā)作（4/4），并維持了大約5分鐘的竇性心律（圖6C-D）�？傊�，CS-CREM小鼠顯示出作為體內(nèi)藥物試驗(yàn)的理想AF模型的前景。

Figure 6. 靜脈注射胺碘酮和普羅帕酮終止CS-CREM小鼠的AF
 

結(jié)論：
研究通過在小鼠中心臟特異性過表達(dá)CREM-IbΔC-X，建立了一個新的ACM模型。CS-CREM小鼠代表了一種穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、通用的模型，在研究ACM的機(jī)制和治療靶點(diǎn)具有很大前景。