光固化生物3D打印教程之高精度水凝膠支架制造
投影式光固化生物打印(Projection-based 3D bioprinting, PBP)具有精度高、速度快、自支撐等優(yōu)勢，近年來在生物制造領域有越來越多PBP的成功應用案例。然而，完全理解PBP的原理需要光學、高分子、工程、生物學等綜合學科的背景知識，初學者熟練掌握PBP的流程也需要經(jīng)歷長時間的試錯與經(jīng)驗積累。降低PBP的入門使用門檻，可使更多研究者能從這項技術中受益。
近期，EFL團隊基于其多年相關經(jīng)驗，在Bio-Design and Manufacturing雜志上發(fā)表題為“Projection-based 3D bioprinting for hydrogel scaffold manufacturing”Technical note，給出了一個標準的水凝膠支架打印流程，我們將PBP生物支架打印分為了“材料配制”、“支架打印”、“后處理”與“細胞接種”四個工序，給出了標準化的操作方法，整理了很多常見的問題、技巧及背后機制。通過這篇教程，希望能夠幫助PBP初學者，降低非工程學科背景使用者在工藝測試上的時間和成本，將PBP作為得力工具加速其研究。論文一作為孫元博士生，通訊作者為賀永教授。
【PBP工作流程】
1. 材料配制：
介紹用于投影式光固化打印的GelMA光敏水凝膠的組成成分、配比、配制方法、儲存方法、各成分打印功能機理。與常規(guī)三維細胞培養(yǎng)不同的是在材料中添加了可以降低打印誤差的吸光劑。除標準化流程外，特別強調(diào)了兩個實用的小技巧：先使用冷溶劑潤濕各成分后再加熱溶解，以及通過離心方法除去溶解后產(chǎn)生的大量微氣泡能夠顯著提升打印質量。
2. 支架打�。�
因為相關打印設備的商業(yè)化，打印過程的設置已變得非常簡便，而打印參數(shù)設置通常軟件里也配有推薦值，初學者可根據(jù)軟件提示一鍵打印。然而作者重點提示了兩個打印過程中常見的問題：模型擺放方向與打印件脫落，闡釋了打印時間、x-y平面與z方向制造精度差異與模型擺放方向間的關系，介紹了采用打印原液對平臺涂底的防脫落實用技巧。
3. 后處理：
后處理是很多熟悉PBP的研究者都容易忽略的過程，科學的后處理不僅可以大大延長支架的儲存時間，而且能提升成品精細結構精度與細胞粘附能力。后處理包括：清除剩余的未交聯(lián)材料、消毒、生物因子處理、凍干等標準步驟。
4. 細胞接種：
與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿或孔板中平面接種細胞不同，PBP打印的水凝膠支架通常具有復雜的三維形貌，為復雜的曲面接種細胞通常需要多角度多次接種。文中以空心管狀結構為例，介紹了如何將內(nèi)腔鋪滿細胞的標準化操作方法與其背后的原理。
【實驗案例】
圖2 管狀支架應用案例
管狀結構廣泛存在于生物體內(nèi)，如血管、髓鞘、膽管等。作者按PBP標準流程進行操作，并給出了各環(huán)節(jié)的具體參數(shù)。通過PBP打印支架再接種的方法能夠制造出含有單層均勻布滿內(nèi)腔的內(nèi)皮細胞層血管模型。
【討論：載細胞打印 vs 支架接種細胞】
如今載細胞打印技術也已非常成熟，為什么我們還需要先制造支架再進行接種的分步方案？作者給出了以下兩點重要理由：
1. 空間分離避免成形性與生物性的矛盾：
生物材料需要兼具生物性能與成形性能，但這兩者通常是矛盾的，優(yōu)異的生物性能需要多孔疏松的材料來降低對細胞的約束，提升物質的交換，這勢必會降低交聯(lián)過程中交聯(lián)基團間發(fā)生反應的概率，降低成形性。這是細胞處于水凝膠內(nèi)部三維包裹時的情況，即載細胞打印時無法避免的問題。然而，支架打印剝離了制造與細胞培養(yǎng)的過程，制造過程中無細胞，接種過程中細胞實際以二維鋪展狀態(tài)粘附在三維支架表面。兩個過程不再彼此制約，從而可以制造出更加復雜的支架結構用于搭載細胞。
2. 時間分離降低復雜度便于交叉合作：
載細胞打印時，必須同時滿足材料、制造、細胞等前提條件，受到細胞活性的限制，整個過程必須在短時間內(nèi)完成。從研究者的實驗角度考慮，這需要完整的材料、工程、生物因素同時在場，無疑在無形中大大提升了門檻。而支架打印完全可以提前做好支架并凍干保存，然后待細胞狀態(tài)合適時再進行接種。這降低了完整流程的復雜度、提升了成功率、也方便不同學科間的交叉合作。
文章來源：
https://doi.org/10.1007/s42242-022-00189-0
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近期，EFL團隊基于其多年相關經(jīng)驗，在Bio-Design and Manufacturing雜志上發(fā)表題為“Projection-based 3D bioprinting for hydrogel scaffold manufacturing”Technical note，給出了一個標準的水凝膠支架打印流程，我們將PBP生物支架打印分為了“材料配制”、“支架打印”、“后處理”與“細胞接種”四個工序，給出了標準化的操作方法，整理了很多常見的問題、技巧及背后機制。通過這篇教程，希望能夠幫助PBP初學者，降低非工程學科背景使用者在工藝測試上的時間和成本，將PBP作為得力工具加速其研究。論文一作為孫元博士生，通訊作者為賀永教授。
【PBP工作流程】
圖1 PBP操作流程圖（以EFL-8601打印機為例說明）
1. 材料配制：
介紹用于投影式光固化打印的GelMA光敏水凝膠的組成成分、配比、配制方法、儲存方法、各成分打印功能機理。與常規(guī)三維細胞培養(yǎng)不同的是在材料中添加了可以降低打印誤差的吸光劑。除標準化流程外，特別強調(diào)了兩個實用的小技巧：先使用冷溶劑潤濕各成分后再加熱溶解，以及通過離心方法除去溶解后產(chǎn)生的大量微氣泡能夠顯著提升打印質量。
2. 支架打�。�
因為相關打印設備的商業(yè)化，打印過程的設置已變得非常簡便，而打印參數(shù)設置通常軟件里也配有推薦值，初學者可根據(jù)軟件提示一鍵打印。然而作者重點提示了兩個打印過程中常見的問題：模型擺放方向與打印件脫落，闡釋了打印時間、x-y平面與z方向制造精度差異與模型擺放方向間的關系，介紹了采用打印原液對平臺涂底的防脫落實用技巧。
3. 后處理：
后處理是很多熟悉PBP的研究者都容易忽略的過程，科學的后處理不僅可以大大延長支架的儲存時間，而且能提升成品精細結構精度與細胞粘附能力。后處理包括：清除剩余的未交聯(lián)材料、消毒、生物因子處理、凍干等標準步驟。
4. 細胞接種：
與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿或孔板中平面接種細胞不同，PBP打印的水凝膠支架通常具有復雜的三維形貌，為復雜的曲面接種細胞通常需要多角度多次接種。文中以空心管狀結構為例，介紹了如何將內(nèi)腔鋪滿細胞的標準化操作方法與其背后的原理。
【實驗案例】
圖2 管狀支架應用案例
管狀結構廣泛存在于生物體內(nèi)，如血管、髓鞘、膽管等。作者按PBP標準流程進行操作，并給出了各環(huán)節(jié)的具體參數(shù)。通過PBP打印支架再接種的方法能夠制造出含有單層均勻布滿內(nèi)腔的內(nèi)皮細胞層血管模型。
【討論：載細胞打印 vs 支架接種細胞】
如今載細胞打印技術也已非常成熟，為什么我們還需要先制造支架再進行接種的分步方案？作者給出了以下兩點重要理由：
1. 空間分離避免成形性與生物性的矛盾：
生物材料需要兼具生物性能與成形性能，但這兩者通常是矛盾的，優(yōu)異的生物性能需要多孔疏松的材料來降低對細胞的約束，提升物質的交換，這勢必會降低交聯(lián)過程中交聯(lián)基團間發(fā)生反應的概率，降低成形性。這是細胞處于水凝膠內(nèi)部三維包裹時的情況，即載細胞打印時無法避免的問題。然而，支架打印剝離了制造與細胞培養(yǎng)的過程，制造過程中無細胞，接種過程中細胞實際以二維鋪展狀態(tài)粘附在三維支架表面。兩個過程不再彼此制約，從而可以制造出更加復雜的支架結構用于搭載細胞。
2. 時間分離降低復雜度便于交叉合作：
載細胞打印時，必須同時滿足材料、制造、細胞等前提條件，受到細胞活性的限制，整個過程必須在短時間內(nèi)完成。從研究者的實驗角度考慮，這需要完整的材料、工程、生物因素同時在場，無疑在無形中大大提升了門檻。而支架打印完全可以提前做好支架并凍干保存，然后待細胞狀態(tài)合適時再進行接種。這降低了完整流程的復雜度、提升了成功率、也方便不同學科間的交叉合作。
文章來源：
https://doi.org/10.1007/s42242-022-00189-0
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