一．嵌合抗體簡(jiǎn)介

人-鼠嵌合抗體，即抗體的可變區(qū)來自鼠單克隆抗體，而恒定區(qū)則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接,插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力，又大大減少了鼠源性在人體內(nèi)的免疫原性，其半衰期明顯延長(zhǎng)，且在介導(dǎo)CDC及ADCC方面亦明顯增強(qiáng)。

圖1 嵌合抗體示意圖

二．嵌合抗體制備（關(guān)鍵技術(shù)與方法）

1. 可變區(qū)基因克隆

1.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞株約10⁷個(gè)細(xì)胞，按照Trizol RNA提取試劑盒的說明書抽提細(xì)胞的總RNA，再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

1.2 擴(kuò)增輕鏈、重鏈的V區(qū)基因

根據(jù)Orlandi等（1989）設(shè)計(jì)的擴(kuò)增小鼠可變區(qū)基因的引物，以上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板擴(kuò)增抗體基因的可變區(qū)�；厥罩劓淰H（約360 bp）、輕鏈VL （約330bp）片段，插入Teasy載體，各送3份樣品測(cè)序。測(cè)序所得序列在GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分類及同源性分析。

兩端加入酶切位點(diǎn)：根據(jù)上述PCR產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物，再次進(jìn)行擴(kuò)增，以使抗體可變區(qū)基因片段具有與載體相吻合的酶切位點(diǎn)，便于插入表達(dá)載體。回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

2. 嵌合抗體表達(dá)載體構(gòu)建

2.1 改造含信號(hào)肽人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段的單克隆位點(diǎn)

設(shè)計(jì)含重鏈信號(hào)肽起始位點(diǎn)序列及酶切位點(diǎn)Nhe I的上游引物HLF （KOZAK+4G,即GCCGCCATGG），和含Xho I位點(diǎn)的下游引物HLR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴(kuò)增出重鏈信號(hào)肽基因片段；設(shè)計(jì)含XhoI和KpnI位點(diǎn)上游引物HCF，和含F(xiàn)urin（RKRR）序列及酶切位點(diǎn)Xba I的下游引物HCR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴(kuò)增出重鏈恒定區(qū)基因片段片段；用Xho I連接上述片段得到含重鏈信號(hào)肽、MCS及重鏈恒定區(qū)的基因片段。

設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)Apa I的上游引物L(fēng)LF，和含EcoR I位點(diǎn)的下游引物L(fēng)LR，以質(zhì) 粒pAc-K-CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈信號(hào)肽基因片段；設(shè)計(jì)含EcoR I和Hind I位點(diǎn)上游引物L(fēng)CF，和含Pme I的下游引物L(fēng)CR，以質(zhì)粒pAc-K-CH3為模板，擴(kuò)增出輕鏈恒定區(qū)基因片段片段；用EcoR I連接上述片段得到含輕鏈信號(hào)肽、MCS及輕鏈恒定區(qū)的基因片段。

2.2 構(gòu)建含信號(hào)肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因片段表達(dá)空載體

用合成的含酶切位點(diǎn)（XbaI和ApaI）的2A序列連接上述重、輕鏈，得到含信、號(hào)肽及人Ig重鏈和輕鏈C區(qū)基因的基因片段LigC （Leader + Ig Constant）。然后與Nhe I和Pme I雙酶切過的pcDNA3.1-CA大片段連接，即得到嵌合抗體真核雙表達(dá)載體 pcDNA3. 1-CA（ chimeric antibody, CA）。

圖2 pcDNA3.1圖譜

2.3 插入含數(shù)源Ig重鏈和輕鏈V區(qū)基因

雙酶切表達(dá)載體pcDNA3.1-CA和純化的VL，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段后，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出pcDNA3.1-CA-VL陽(yáng)性克隆，富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。然后，雙酶切表達(dá)載體pcDNA3.1-CA-VL和純化的VH，分離純化相應(yīng)的酶切片段，重復(fù)上述步驟，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pcDNA3.1-CA-XX（抗原單詞的首字母）。

3. 轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞

接種適量Sp2/0細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12h后用純化的載體pcDNA3.1-CA-XX DNA，采用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染，按試劑盒使用說明書進(jìn)行。設(shè)置空載體和無(wú)載體的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染72h后，加含MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。2周后將生長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆利用有限稀釋法單克隆化。

4. 陽(yáng)性克隆鑒定與篩選

以間接法用抗原和酶標(biāo)羊抗人IgGFc片段抗體檢測(cè)嵌合抗體的特異性及重組性。以適量抗原包被酶標(biāo)板，加細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶標(biāo)抗體（經(jīng)鼠Ig吸附過）孵育，顯色后測(cè)A490吸光值。

5. 抗體腹水生產(chǎn)

腹腔種植轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞，5~7天后抽取腹水。一只種植雜交瘤細(xì)胞的小鼠有時(shí)可產(chǎn)生多達(dá)10ml的腹水。王碩等（2003）報(bào)道稱從腹水中獲得的嵌合抗體產(chǎn)量可達(dá)1~2mg/ml。

三．嵌合抗體的應(yīng)用

嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面，與鼠抗相比，嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應(yīng)的發(fā)生幾率，改善了臨床治療效果，與其它小分子基因工程抗體相比，嵌合抗體作為完成的抗體分子，在體內(nèi)半壽期更長(zhǎng)，并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能。