新型灌注生物反應(yīng)器促進(jìn)多能干細(xì)胞在3D生物打印組織腔室中擴(kuò)增的應(yīng)用
摘要
隨著3D生物打印和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的出現(xiàn)，組織工程領(lǐng)域發(fā)展迅速，但由于缺乏功能豐富的厚組織，影響有限。繞過這一限制的方法之一是用含有 hiPSCs 的3D 生物打印組織。通過這種方式，iPSCs可以在實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化之前增殖并填充厚組織塊。在這里,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)灌注生物反應(yīng)器，用于裝載hipsc的3d生物打印室， 目的是在分化之前在 整個(gè)結(jié)構(gòu)中增殖hipsc，以產(chǎn)生厚組織模型。生物反應(yīng)器由數(shù)字光投影制成，經(jīng)過優(yōu)化，可 以在水凝膠室內(nèi)部灌注而不會(huì)泄漏，也可以在外部提供流體流動(dòng)，從而最大限度地提高整 個(gè)室壁的營(yíng)養(yǎng)輸送。經(jīng)過7天的培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)在3ml min-1下間歇灌注(每15分鐘15秒)，相 對(duì)于在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的類似腔室，工程組織中的干細(xì)胞集落密度增加了1.9倍。我們還觀 察到，相對(duì)于靜態(tài)對(duì)照，灌注結(jié)構(gòu)的組織壁內(nèi)的菌落分布更均勻，反映了培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的均勻分布。在流體流動(dòng)的作用下，hiPSCs保持多能性和增殖性，產(chǎn)生平均約1.0 dyncm-2 的壁剪切應(yīng)力�？偟膩碚f，這些充滿希望的結(jié)果在灌注干細(xì)胞水凝膠后支持多種組織類 型的產(chǎn)生，并改善了厚度，因此增加了功能和實(shí)用性。
1. 介紹
三維（3D）生物打印技術(shù)為創(chuàng)建人體疾病模 型提供了巨大的潛力，可以在體外對(duì)疾病機(jī)制、 進(jìn)展和治療進(jìn)行器官級(jí)研究。生物打印還可以生 成功能性替代組織，用于治療各種疾病。然而， 人體每個(gè)器官都有數(shù)十億個(gè)細(xì)胞，要獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞來創(chuàng)建具有代表性的體外組織并非易事 。雖然擠壓生物打印的細(xì)胞密度通常高于其他打 印方式，但目前通常只能達(dá)到每毫升生物墨水?dāng)?shù) 千萬個(gè)細(xì)胞的規(guī)模[1]。目前正在開發(fā)使用球體 或胚狀體進(jìn)行無支架生物打印的方法[2-4]，從而提高打印組織的細(xì)胞密度。然而，除了自身的一系列局限性（包括球形變異性、可打印性和打印分辨率方面的挑戰(zhàn)）外，這些方法仍然需要細(xì)胞放大和大容量培養(yǎng)基才能達(dá)到生理密度。為了解決工程組織中細(xì)胞密度低的問題，人們引入了原位干細(xì)胞擴(kuò)增和分化的生物打印方法[5-11]。在這種方法中，被打印在生物墨水中的是干細(xì)胞而不是實(shí)質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞在分化成所需細(xì)胞類型之前，可在工程組織中擴(kuò)增。這對(duì)涉及增殖或遷移能力有限的細(xì)胞類型（如心肌細(xì)胞）的應(yīng)用尤其有益，也可作為使用源自患者的原始細(xì)胞的替代方法[5, 12, 13]。這種方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在分化過程中形成的關(guān)鍵細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和 ECM-ECM 連接可以保持不變，不會(huì)被破壞。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)?ECM 組織對(duì)工程心臟組織的功能至關(guān)重要[14]。此外，在原位分化過程中形成并保存在三維生物打印結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境可實(shí)現(xiàn)人腔肌泵（hChaMP）的組織和心臟功能[5]。使用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）打印的hChaMP 是由一種生物墨水生成的，這種墨水含有專門針對(duì) hiPSC 生長(zhǎng)和分化為心肌細(xì)胞而優(yōu)化的 ECM。hiPSCs 在心肌細(xì)胞分化前增殖兩周，從而使結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞密度更符合生理要求。因此，hChaMP 在整個(gè)結(jié)構(gòu)中顯示出連續(xù)的肌肉功能，這一點(diǎn)可以通過光學(xué)繪圖和肌肉組織每次收縮時(shí)泵送液體的能力來證明。然而，雖然使用干細(xì)胞進(jìn)行生物打印以及隨后的擴(kuò)增和分化是一項(xiàng)很有前景的技術(shù)，但由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，hChaMP顯示出有限的組織厚度[5]，這是組織工程領(lǐng)域眾所周知的問題。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（尤其是氧氣）的供應(yīng)限制了工程組織的厚度，通常只能達(dá)到 100-200 微米的存活組織[15]。然而，有了流體流動(dòng)，就可以通過對(duì)流擴(kuò)大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取，從而開發(fā)出許多用于工程組織的生物反應(yīng)器[16, 17]。由于多能干細(xì)胞對(duì)微環(huán)境敏感，而剪切應(yīng)力已被證明可誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞造血[18]，并促進(jìn)干細(xì)胞衍生前體形成內(nèi)皮細(xì)胞[19, 20]，因此在工程組織中對(duì)流擴(kuò)增hiPSC可能會(huì)誘發(fā)無意分化。相反，許多生物反應(yīng)器研究表明，利用流體力學(xué)擴(kuò)增干細(xì)胞聚集體或微載體，其效力損失有限[21-25]。在此，我們介紹了為hChaMP開發(fā)的灌注生物反應(yīng)器。我們的研究表明，間歇灌注hChaMP可使細(xì)胞密度在培養(yǎng)一周后增加近兩倍。
此外，盡管暴露在剪切應(yīng)力下，hiPSCs仍能保持多能性，而剪切應(yīng)力近似低于其他常見的干細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器。這些結(jié)果表明，擴(kuò)增的iPSCs分化成所需細(xì)胞類型后，有望生成厚組織模型。
2. 材料與方法
2.1. hChaMP制造
通過Autodesk Meshmixer和Blender（圖1(a)），根據(jù)之前報(bào)道的結(jié)構(gòu)[5]重新設(shè)計(jì)了hChaMPs ，并在Slic3r中生成了g代碼。打印前一天，在含有 75% mTeSR1（STEMCELLTechnologies，cat#85850）、25% 醋酸（20 mM）和1.3% 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（LAP，Allevi）的溶液中，將甲基丙烯酰明膠（GelMA；明尼蘇達(dá)大學(xué)生物打印設(shè)備）在60℃下重組至 26.7% w/v。甲基丙烯酸膠原（ColMA；Advanced Biomatrix，cat#5198）在 20 µM乙酸中溶解至2% w/v，溫度為37℃。打印前，混合GelMA和ColMA溶液（3:1 GelMA溶液：ColMA溶液，即 20% w/v GelMA，0.5% w/v ColMA），并用1M 氫氧化鈉中和。這些研究中使用了 hiPSCs（在肌球蛋白重鏈基因[26]下過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白 D2，雌性）。hiPSCs 在 基底膜基質(zhì)（Corning，cat#08-774-552）上的 mTeSR1 中保存，并通過 ReLeSR（STEMCELL Technologies，cat#05872）定期傳代。打印時(shí)，用細(xì)胞消化液（Millipore Sigma，cat#A6964）將匯合度為 60%-80% 的 hiPSCs單個(gè)化。細(xì)胞懸浮液清洗后離心兩次，以除去可能降解基質(zhì)支架的多余細(xì)胞消化液。然后將細(xì)胞以 3000 萬個(gè)細(xì)胞 ml-1 的量重懸在 ECM 溶液中，該溶液含有 187 µg ml-1 小鼠層粘連蛋白/腸粘連蛋白（LN；Corning，cat#354259）、187µg ml-1 人纖連蛋白（FN；Corning，cat#356008 或 R&D systems，cat#1918-FN-02M）和10 µM Y-27632 ROCK 抑制劑（Selleckchem，cat#S1049）的 mTeSR1，并在室溫下孵育 15 分鐘。hChaMPs 在INKREDIBLE擠壓式生物打印機(jī)（CELLINK）上打印。為了提高低粘度生物墨水的分辨率，打印是在基于 FRESH v2.0[27]的支撐浴中進(jìn)行的。支撐浴是在生物安全柜中制作的，以保持無菌狀態(tài)；52.5%的無菌Milli-Q水和47.5%的乙醇混合物在輔助容器中制作的水浴中加熱到45℃。以每分鐘400轉(zhuǎn)的速度攪拌混合物，并用鋁箔覆蓋以減少蒸發(fā)。加入氫氧化鈉（1mM）使pH值升至7，然后加入B型明膠（SigmaAldrich，cat#G9382，2% w/v）和阿拉伯樹膠（Sigma Aldrich，cat#9752，1% w/v）。溶液在45℃下混合10分鐘，然后冷卻至35℃，然后緩慢冷卻至25℃(<1℃ min-1)。然后降低溫度至10℃，再攪拌5分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移到錐形管中，在100G下離心4分鐘。將上清替換為冷的、無菌的Milli-Q水，管子旋轉(zhuǎn)，在500G下離心5分鐘。然后用冷的、無菌的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;Fisher Scientific, cat#BP3994)，并保存在4℃，直到打印當(dāng)天。此時(shí)，在1200G下離心3分鐘，去除多余的PBS，薄層紫外線照射30分鐘。生物墨水在27°C下用27 G, 1英寸針頭打印。如前所述[5]，為了保持打印結(jié)構(gòu)的一致性(這對(duì)灌注設(shè)置很重要)，壓力根據(jù)針頭的墨水滴速而變化。對(duì)于給定的打印結(jié)構(gòu)，這里使用的墨水，滴針之間的滴速為3.1秒。在六個(gè)面各打印20秒后，墨水與藍(lán)光(405 nm)交聯(lián)。然后將支撐液中的打印物移到培養(yǎng)箱中熔化支撐液，然后用溫暖、無菌的Dulbecco PBS (DPBS;不含Ca2+和Mg2+;Thermo Fisher Scientific，編號(hào)14190144)。hChaMPs在5µM Y-27632的mTeSR1中培養(yǎng)過夜，在靜態(tài)條件下允許細(xì)胞附著。
圖1所示。hChaMP和生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)。(a)hChaMP模型橫切面(正面)為灌注腔內(nèi)。(b)生物3d打印的hChaMP。(c)生物 反應(yīng)器模型，生物反應(yīng)器的側(cè)視圖，包括頂部和底部部分(上)和底部部分的自頂向下視圖(下),底部部分為hChaMP。
該設(shè)計(jì)允許灌注hChaMP 內(nèi)部(實(shí)箭頭),以及圍繞hChaMP 外部的流體流動(dòng)(虛線箭頭)。hChaMP 輕輕放置在細(xì)水平桿上 ,允許在hChaMP底部周圍進(jìn)行外部灌注。(d)3d 打印生物反應(yīng)器，由螺母、螺栓和硅膠墊圈組裝而成。(e)生物反應(yīng)器 中的hChaMP。油管將hChaMP連接到生物反應(yīng)器。(f)整個(gè)灌注裝置，生物反應(yīng)器連接到泵和介質(zhì)儲(chǔ)存器。
2.2. hChaMP 灌注
在SOLIDWORKS中設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器，其中hChaMP內(nèi)部灌注端口(Ini和Outi)和hChaMP外部流動(dòng)端口(Ine和Oute)(圖1(c))。生物反應(yīng)器通過Perfactory IV數(shù)字光投影打印機(jī)(EnvisionTEC)使用E-shell 300 (EnvisionTEC,cat#1500300)進(jìn)行3d打印(圖1(d))。灌注時(shí)，使用Masterflex L/S標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字驅(qū)動(dòng)器(cat#07522-30)與Masterflex L/S 14鉑固化硅膠管(1.6 mm ID, cat#96410-14)。培養(yǎng)基儲(chǔ)液器是一個(gè)50 ml的錐形管，蓋子上有三個(gè)孔，兩個(gè)用于流體的進(jìn)出口，一個(gè)用于0.22µm注射器過濾器(Whatman, cat#6780-2502)，允許在培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌氧氣交換。培養(yǎng)基儲(chǔ)層最初填充兩倍體積的培養(yǎng)基(mTeSR Plus [STEMCELLTechnologies, cat#100-0276])，并添加100 μml - 1青霉素，100 μ ml - 1鏈霉素[penp -strep;Thermo Fisher Scientific, cat#15140122]用于灌注的第一天)，而不是管道和生物反應(yīng)器中所需的系統(tǒng)。這樣，在隨后的日子里，只需簡(jiǎn)單地更換錐形管，就可以更換 50%的培養(yǎng)基（mTeSR Plus，no pen-strep），從而最大限度地減少排空管道時(shí)可能發(fā)生的污染和氣泡形成。靜態(tài)對(duì)照在具有等量培養(yǎng)基的立式T25燒瓶中培養(yǎng)，每天也更換50%的培養(yǎng)基。
打印1天后開始灌注。生物反應(yīng)器在生物安全柜中紫外線照射下，70%乙醇浸泡30分鐘滅菌。然后用無菌的1X PBS洗滌生物反應(yīng)器三次。為了準(zhǔn)備hChaMP進(jìn)行灌注(圖S1)，將hChaMP移至有溫DPBS的培養(yǎng)皿中。硅膠管(15mm長(zhǎng)，2mm內(nèi)徑，3mm外徑;將uxcell (cat#a19011600ux0295)插入hChaMP的兩條血管中。將插入管的hChaMP移至干凈、干燥的培養(yǎng)皿中，在管和hChaMP的界面處移液無菌的20% GelMA(含0.5% w/v LAP，如上所述溶解于mTeSR1和乙酸中)，同時(shí)用藍(lán)光交聯(lián)。將hChaMP移動(dòng)到充滿DPBS的生物反應(yīng)器中，使用無菌細(xì)齒鉗將管的另一端插入生物反應(yīng)器通道中(圖1(e))。20%的GelMA被添加到每根油管的兩端，以形成防止泄漏的密封。Outi的管(Masterflex C-Flex管，3.2 mm ID，編號(hào)06422-04)充滿DPBS，并連接到生物反應(yīng)器上，以消除Outi的表面張力，這種張力會(huì)產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP的灌注。為了檢查內(nèi)部灌注是否有泄漏，用食用色素染色的DPBS(通過0.22µm過濾器過濾)用注射器和針頭注射到Ini。如果油管連接處存在泄漏，則使用20%以上的GelMA。染色的DPBS用mTeSR Plus溫水沖洗。然后將生物反應(yīng)器連接到灌注裝置上。將生物反應(yīng)器連接到引管上，在生物反應(yīng)器上放置30mm硅膠墊片，并用螺母和螺栓固定生物反應(yīng)器蓋。將泵打開至3ml min - 1，以去除生物反應(yīng)器中剩余的空氣。將灌注設(shè)置(圖1(f))移至培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)，并將流量改為間歇，每15分鐘以3ml min - 1的速度流動(dòng)15 s。每天進(jìn)行50%的介質(zhì)更換，直到灌注結(jié)束。
2.3. 計(jì)算模擬
為了建立 hChaMP 中流體流動(dòng)的計(jì)算模型，在生物反應(yīng)器的入口和出口處測(cè)量了流動(dòng)下的壓力。簡(jiǎn)言之，如上所述，將無細(xì)胞 hChaMP 插入生物反應(yīng)器并連接流動(dòng)。在生物反應(yīng)器入口或出口的底部放置止血閥（Qosina，cat#80395），以便在設(shè)置中插入壓力導(dǎo)管。使用 ADV500 PV系統(tǒng)和 1.4 Fr 壓力導(dǎo)管（Transonic）測(cè)量壓力曲線，數(shù)據(jù)采集采樣率為 5000 Hz。在Simvascular中使用流固相互作用(FSI)方法來解析內(nèi)部流動(dòng)[28]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用彈性模量為1.96 kPa的新hookean模型來描述墻。流體模型采用牛頓流體模型，粘度為1 cP，用波形描述進(jìn)口的間歇流動(dòng)，并在出口施加與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相匹配的壓力作為邊界條件。為了穩(wěn)定系統(tǒng)中的壓力，在明尼蘇達(dá)超級(jí)計(jì)算研究所進(jìn)行了十個(gè)周期的模擬。外部流動(dòng)使用Ansys Fluent, release 20.1進(jìn)行求解，假設(shè)墻壁是剛性的。與內(nèi)部流動(dòng)模擬一樣，將流體描述為粘度為1 cP的牛頓流體，并施加一個(gè)波形作為進(jìn)口邊界條件，其流量與內(nèi)部流動(dòng)模擬的出口結(jié)果相匹配。出口設(shè)為零參考?jí)毫Α?br />
2.4.冷凍切片和免疫熒光(IF)染色
培養(yǎng)7天后，去除hChaMP底部(頂端)進(jìn)行核糖核酸(RNA)提取(見下文)。剩余的hChaMP在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜。第二天，hChaMPs用1X PBS洗滌三次。hChaMP腔室(在血管和切除的頂點(diǎn)之間)被切成兩部分，以便從結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域進(jìn)行切片。切片前，樣品在30% w/v蔗糖的PBS中4?C孵育2 d。為了準(zhǔn)備冷凍樣品，將樣品移動(dòng)到30%蔗糖:O.C.T.的1:1混合物中化合物(Tissue-Tek，編號(hào)25608-930)孵育1.5小時(shí)，然后在O.C.T.化合物中低溫模孵育3小時(shí)。然后將樣品在-80℃下冷凍。使用徠卡CM1900低溫恒溫器對(duì)樣品進(jìn)行10µm厚度的切片。將載玻片置于室溫下過夜，第二天使用或移至- 20℃。為了通過hChaMP成像細(xì)胞分布，切片用5µg ml?1 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen, cat#D1306)染色8分鐘，然后用DAPI/1,4-重氮雜環(huán)[2,2,2]辛烷(DABCO;Sigma-Aldrich, cat#D27802)在甘油和PBS。在徠卡DMi8熒光顯微鏡下，將載玻片成像為瓦片。為了量化ImageJ中的菌落密度，使用瓦片掃描明場(chǎng)圖像跟蹤切片的邊緣，將dapi標(biāo)記的瓦片掃描進(jìn)行二值化，并使用Analyze Particles功能識(shí)別大于或等于1000µm2的細(xì)胞菌落。每個(gè)hChaMP分析了5個(gè)切片。通過在明場(chǎng)切片(菌落不容易可視化的地方)上沿著每個(gè)切片的厚度(從室外到室內(nèi))繪制10條線來定量分布，然后沿著每條線找到二值化DAPI的Plot Profile。在Microsoft Excel中分析剖面，以確定在組織厚度的每五分之一段內(nèi)發(fā)生的情況。平均壁厚計(jì)算為所有線的平均長(zhǎng)度。對(duì)于IF，用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat#T8787)滲透1小時(shí)，用5%牛血清白蛋白、1%甘氨酸、2%山羊血清和0.1% Triton X-100 (BGST)的溶液阻斷2小時(shí)。在BGST中，一級(jí)抗體(1µg ml-1小鼠anti-OCT3/4 [Santa CruzBiotechnology, cat#sc-5279]， 5µg ml-1小鼠anti-KI67 [BD Biosciences, cat#556003]，和2.5µg ml-1兔 anti-PAX6 [Invitrogen, cat#42-6600]，圖S2)在4℃下在切片上孵育過夜。在次級(jí)抗體(4µg ml-1 AlexaFluor 647羊 anti-mouse[Invitrogen, cat#A21236]或AlexaFluor 647羊anti-rabbit [Invitrogen, cat#A32733])中孵育2小時(shí)前，用0.2% Tween-20 (Millipore, cat#655204)在1XPBS中洗滌2次，用1XPBS洗滌1次。樣品再次用Tween-20和PBS洗滌，然后用DAPI染色，并如上所述用DAPI/DABCO涂載。采集菌落20×圖像，在ImageJ中定量熒光標(biāo)記面積。具體來說，DAPI圖像是二值化的，并且使用AnalyzeParticles特征來跟蹤集落邊界，作為集落小于1000µm2的感興趣區(qū)域(roi)。然后對(duì)相應(yīng)的IF圖像進(jìn)行二值化處理，將每個(gè)ROI內(nèi)標(biāo)記物覆蓋的面積量化歸一化為相應(yīng)ROI內(nèi)的DAPI密度。對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，每個(gè)hChaMP分析了>30個(gè)菌落。
2.5. RT-qPCR
用刀片輕輕去除hChaMPs的頂端，并在液氮罐中快速冷凍，以備將來提取RNA。樣品裂解并使用PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen，編號(hào)12183018A)分離RNA。使用Gen5軟件在Cytation3成像閱讀器(BioTek)上定量RNA的質(zhì)量和數(shù)量。cDNA使用SuperScript IV VILO MasterMix (Invitrogen, cat#11756050)根據(jù)制造商的說明創(chuàng)建。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)使用PowerSYBR Green Master Mix (1X,Applied Biosystems, cat#4367659)在RocheLightCycler 96(多能性標(biāo)記，60°C退火)或Eppendorf Mastercycler ep realplex2(胚層標(biāo)記，55°C退火)上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。標(biāo)記物的表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。引物序列來源于文獻(xiàn)(Integrated DNA Technologies，表S1)，并根據(jù)primer-blast[29]中所關(guān)注基因的特異性和低二聚化可能性，根據(jù)Integrated DNATechnologies 的 OligoAnalyzer Tool 選擇引物對(duì)。陽性對(duì)照的hipsc衍生的胚層組織如補(bǔ)充信息中所述。
2.6. 統(tǒng)計(jì)
每種情況下測(cè)試三個(gè)hChaMPs。在JMP Pro16.0中進(jìn)行樣本組比較。對(duì)不相等均值(雙尾)的零假設(shè)計(jì)算p值，置信區(qū)間為95%。采用學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算靜態(tài)和灌注hChaMPs的p值，而RT-qPCR的多個(gè)條件采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)和事后Tukey-Kramer誠(chéng)實(shí)顯著性差異(HSD)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
3. 結(jié)果
3.1. 生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與灌注參數(shù)的選擇為灌注設(shè)計(jì)的hChaMP結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示(視頻S1)。該結(jié)構(gòu)在先前報(bào)道的結(jié)構(gòu)[5]基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，作為單個(gè)心室，允許未來通過施加流體流動(dòng)和機(jī)械閥驅(qū)動(dòng)來建模心室功能(即泵送)。hChaMP是通過擠壓打印的生物打印(圖1(b))，由含有hiPSCs(1500萬ml - 1細(xì)胞)、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、甲基丙烯化膠原蛋白、層粘連蛋白/腸動(dòng)蛋白和纖維連接蛋白的生物墨水形成。由于ecm支架的微妙性質(zhì)，其存儲(chǔ)模量為1.79±0.13 kPa(圖S3)，因此設(shè)計(jì)了一個(gè)生物反應(yīng)器來支持hChaMP在整個(gè)灌注過程中(圖1(c) - (e))。短管被用作hChaMP和生物反應(yīng)器之間的連接。將管插入hChaMP中，在連接處加入無菌的20%GelMA并光交聯(lián)以將管密封到位。該生物反應(yīng)器包含一個(gè)隔間，用于穩(wěn)定定位hChaMP，并具有兩個(gè)通道，用于插入連接到hChaMP的管道。生物反應(yīng)器被設(shè)計(jì)成適當(dāng)?shù)匾龑?dǎo)流體通過hChaMP的內(nèi)部，然后繞過外部(圖1(c)和視頻S2-S3)，以最大限度地實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)交換。為了減少通過hChaMP的流體阻力，Outi比Ini大。從Outi流出的水流流入Ine, Ine進(jìn)入hChaMP下方的生物反應(yīng)器隔間，并從hChaMP上方的蓋子流出Oute(圖1(c)和視頻S3)。在完成提供內(nèi)部和外部流動(dòng)的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)后，考慮灌注流速。每30-60分鐘灌注1分鐘，這種不頻繁的灌注方式導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)很少，可能是由于生物反應(yīng)器和hChaMP內(nèi)缺乏氧氣交換以及廢物去除有限。因此，采用每15分鐘15 s的間歇灌注。這種流動(dòng)的持續(xù)時(shí)間允許在hChaMP內(nèi)部完全改變介質(zhì)，并且頻率支持組織內(nèi)的細(xì)胞存活。
值得注意的是，在生物反應(yīng)器中對(duì)hChaMP施加壓力增加的情況下，泄漏將持續(xù)發(fā)生在管道-hChaMP界面。這種壓力限制限制了該模型在下游應(yīng)用中的實(shí)用性，因?yàn)楫?dāng)接口處存在泄漏時(shí)，hChaMP無法達(dá)到更高的壓力。因此，我們探索了提高軟組織對(duì)疏水管粘附性的方法。經(jīng)3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯預(yù)處理(補(bǔ)充方法，圖S5(a))，油管與添加在油管- hchamp界面的GelMA的結(jié)合得到改善。這使得界面可以承受更高的壓力，hChaMP本身在破裂前的最大壓力達(dá)到16.8±0.6 mmHg(圖S5(b)， (c)和視頻S4)。這是系統(tǒng)使用蠕動(dòng)泵(~ 8.2 mmHg)時(shí)的平均壓力的兩倍。然而，這個(gè)最大壓力或“爆裂”壓力被發(fā)現(xiàn)低于蠕動(dòng)泵施加的最大壓力(~ 27.1 mmHg)。這種差異可歸因于蠕動(dòng)泵的振蕩壓力，其中低壓和高壓的快速波動(dòng)導(dǎo)致hChaMP的膨脹和收縮(視頻S3)。在爆炸試驗(yàn)中，壓力被緩慢地直接施加到hChaMP壁上，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不斷膨脹(圖S5(b)和視頻S4)，直到壁上變得太弱而無法容納更多的流體。
3.2. 流體流動(dòng)參數(shù)的近似值
為了近似計(jì)算流體流動(dòng)對(duì)hChaMP的影響，特別是在hChaMP壁面處的壓力和剪切應(yīng)力，進(jìn)行了計(jì)算模擬。將壓力導(dǎo)管插入Ini或Outi底部的止血閥，測(cè)量hChaMP入口和出口的壓力分布。在計(jì)算模型中，將測(cè)量到的壓力剖面的最大值、最小值和平均值作為hChaMP流動(dòng)的輸入。SimVascular svFSI求解器是一款專門用于心血管模擬的開源軟件[28]，用于求解hChaMP的內(nèi)部流動(dòng)曲線。該軟件之前已經(jīng)在體外模型中進(jìn)行了驗(yàn)證，并證明了其在描述流動(dòng)動(dòng)力學(xué)方面的有效性[30]。使用該軟件和hChaMP的3D模型，流體流動(dòng)曲線與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相匹配(圖2(b)、S4和視頻S2)，證實(shí)了該模型復(fù)制系統(tǒng)的能力。這允許計(jì)算在hChaMP內(nèi)壁上產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，這是干細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。
發(fā)現(xiàn)hChaMP內(nèi)的壓力相當(dāng)均勻，在單個(gè)泵循環(huán)中的變化與實(shí)驗(yàn)值相匹配，平均約為4.5-5.3mmHg，最大值為25.5 mmHg(圖2(c))。壓力在其最小值為負(fù)，反映了在泵的脈動(dòng)循環(huán)中所看到的情況。在灌注數(shù)天后，這種壓力的變化似乎沒有引起hChaMP完整性的問題。壁面剪切應(yīng)力變化較小，平均值約為1.0 dyn cm-2，在大部分hChaMP腔室中最大值為2.7 dyn cm-2，盡管在Outi附近隨著流體流出腔室急劇增加，達(dá)到15.0 dyn cm-2(圖2(c))。
由于外流存在復(fù)雜的幾何形狀，采用AnsysFluent求解外流廓線。Fluent是開源軟件SimVascular的商業(yè)替代品，已被廣泛用于心血管系統(tǒng)的流體流動(dòng)模式演示，包括體外模型[31]。求解了外流動(dòng)廓形，實(shí)現(xiàn)了hChaMP外壁面剪應(yīng)力的計(jì)算。外部的壓力和壁面剪切應(yīng)力要低得多，這可能是由于生物反應(yīng)器的大隔間尺寸和從Outi到Ine的壓力下降，導(dǎo)致hChaMP周圍的流量較低(圖2(d) - (f))。
有趣的是，外部的壓力取決于所分析的位置。流體首先與hChaMP接觸的下側(cè)最大壓力高于上側(cè);然而，兩者的差別相當(dāng)小，底部的最大壓力為1.13 × 10-4 mmHg，上部的最大壓力為1.05× 10-4 mmHg。與內(nèi)部流動(dòng)的壓力相似，hChaMP外部的最小壓力略為負(fù)，但在10 - 6 mmHg的量級(jí)上。墻體剪應(yīng)力也遠(yuǎn)低于內(nèi)部，范圍在10-7 -10-5 dyn cm?2之間(圖2(f))�？傮w而言，內(nèi)壁剪切應(yīng)力與干細(xì)胞擴(kuò)增的普通生物反應(yīng)器的剪切應(yīng)力范圍相似，而外部剪切應(yīng)力遠(yuǎn)低于其值，據(jù)報(bào)道約為0.7 - 2.5 dyn cm-2[32-34]。此外，發(fā)現(xiàn)水凝膠中嵌入的干細(xì)胞能夠承受大于30 dyn cm-2的應(yīng)力[22]，這表明我們?cè)O(shè)置的剪切應(yīng)力近似于hiPSC擴(kuò)增是合理的。
3.3. 灌注對(duì)hiPSCs生長(zhǎng)和分布的影響為了確定流體流動(dòng)對(duì)hiPSC增殖和分布的影響，在打印后1 d將hChaMPs插入生物反應(yīng)器中進(jìn)行灌注，使細(xì)胞有時(shí)間附著在結(jié)構(gòu)上(圖3(a))。隨后的每一天，錐形管作為介質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)替換為新鮮介質(zhì)。油管中的介質(zhì)，大約相當(dāng)于系統(tǒng)中總體積的一半，沒有被排干，以防止污染或氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。因此，每天使用mTeSR Plus更換50%的培養(yǎng)基。隨著組織工程中的生物制造技術(shù)變得越來越復(fù)雜，污染風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。然而，干細(xì)胞一般避免使用抗生素，即使是短期治療也是如此[35]。在這里，青霉素鏈霉素在灌注的第一天加入，并在隨后的培養(yǎng)基更換中逐漸稀釋。在這種情況下，短期暴露于青霉素-鏈霉素對(duì)三維培養(yǎng)中單一化hiPSCs的增殖和效力沒有影響（圖S6）。
圖3所示。灌注可改善hiPSC菌落的覆蓋和分布。(a) hChaMP增殖時(shí)間線，打印后第1天開始間歇灌注。(b) hChaMP橫 截面，用DAPI染色(白色)顯示培養(yǎng)7 d后，灌注或不灌注時(shí)整個(gè)hChaMP的細(xì)胞密度。(c)與靜態(tài)對(duì)照相比，灌注樣品中 hChaMP中的菌落密度增加了一倍。(d)間歇灌注不影響壁厚。(e)在hChaMP細(xì)胞壁上劃線，在ImageJ中進(jìn)行處理，確定 菌落在細(xì)胞壁上的分布。灌注后的hChaMPs與靜態(tài)hChaMPs相比，壁中部的菌落明顯增加。在組織壁各區(qū)域進(jìn)行靜態(tài)和灌注hChaMPs的比較。n = 3 hChaMPs。統(tǒng)計(jì)上不顯著;#p < 0.1，*p < 0.05，**p < 0.01)。
此外，與靜態(tài)培養(yǎng)的hChaMPs相比，灌注hChaMPs改善了hiPSC菌落在細(xì)胞壁內(nèi)的分布(圖3(e))。灌注的hChaMPs中，大多數(shù)hipsc位于組織壁的中部，在組織壁的不同區(qū)域間菌落數(shù)量變化較小。另一方面，靜態(tài)對(duì)照的菌落位于hChaMP外側(cè)附近，在整個(gè)組織中的分布較少。有趣的是，灌注和靜態(tài)hChaMP在hChaMP最外層的菌落百分比相對(duì)于下一個(gè)內(nèi)部部分都要低。這可能是由于在支撐槽移除和介質(zhì)改變或灌注過程中細(xì)胞丟失所致。3.4. 灌注對(duì)hiPSC多能性的影響為了測(cè)試來自流體流動(dòng)的剪切應(yīng)力是否會(huì)導(dǎo)致hiPSCs的不良分化，對(duì)hChaMPs的冷凍切片進(jìn)行OCT3/4 IF染色(圖4(a))。集落的定性和定量分析表明，幾乎所有細(xì)胞都保持多能性，多能性與靜態(tài)對(duì)照相當(dāng)。此外，細(xì)胞高度增殖，KI67在整個(gè)菌落中呈陽性表達(dá)(圖4(b))。這表明hipsc在間歇灌注后仍保持其多能性和自我更新特性。接下來，使用RT-qPCR來量化多能性標(biāo)記，以及來自每個(gè)胚層的標(biāo)記，以在轉(zhuǎn)錄物水平上確認(rèn)我們的結(jié)果(圖4(c))。與2D培養(yǎng)的hiPSC對(duì)照相比，在靜態(tài)和灌注狀態(tài)下，OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)均保持較高水平�？偟膩碚f，除了一個(gè)例外，沒有檢測(cè)到胚層標(biāo)記物，或者發(fā)現(xiàn)相對(duì)
于hiPSCs或靜態(tài)hChaMPs的水平不顯著。外胚層標(biāo)志物PAX6在灌注hChaMP細(xì)胞中的表達(dá)高于2DhiPSCs (p=0.044)。然而，IF染色顯示PAX6在hChaMPs中沒有蛋白水平的表達(dá)(圖4(d))。
4. 結(jié)論在這里，我們展示了灌注hiPSCladen生物打印組織的能力，目的是增加工程組織的活細(xì)胞厚度。僅培養(yǎng)7天后，灌注就能顯著提高菌落密度，這是我們通常hChaMP增殖周期的一半。先前的灌注生物反應(yīng)器研究[36-40]發(fā)現(xiàn)，使用原代細(xì)胞類型可以提高組織內(nèi)的生存能力，而我們能夠使用對(duì)環(huán)境高度敏感的多能干細(xì)胞復(fù)制結(jié)果。此外，這些先前的研究通常是直接通過支架的孔隙向組織間質(zhì)灌注。在這里，我們展示了在組織周圍而不是直接通過組織的大體積流體流動(dòng)中獲得類似結(jié)果的能力。因此，本文所描述的與最佳生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、通過精致水凝膠腔灌注以及hipsc的流動(dòng)考慮相關(guān)的概念將為潛在的任何組織類型的研究鋪平道路。在這種結(jié)構(gòu)分化后，可以產(chǎn)生較厚的組織，并伴隨組織功能的增加。
生物反應(yīng)器的開發(fā)是一個(gè)反復(fù)的過程，成功增殖的最重要參數(shù)是對(duì)軟水凝膠的精細(xì)處理和連接處的防泄漏，以確保通過hChaMP內(nèi)部進(jìn)行灌注。早期嘗試以垂直、直立的姿勢(shì)灌注hChaMP，成功地提高了細(xì)胞在內(nèi)部的活力。然而，難以設(shè)置hChaMP進(jìn)行灌注，并且需要一個(gè)小的隔間尺寸來保持hChaMP，最大限度地減少了hChaMP周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體積，使得這些生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)不切實(shí)際。因此，目前的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)將hChaMP放置在仰臥位置，為養(yǎng)分交換提供了簡(jiǎn)單的設(shè)置和足夠的培養(yǎng)基體積。精細(xì)的操作仍然是灌注成功的關(guān)鍵。在hChaMP打印分辨率較差的情況下，管子插入變得更加困難，需要更嚴(yán)格的處理，導(dǎo)致培養(yǎng)第7天菌落形成急劇減少。此外，壓差在確保通過hChaMP內(nèi)部灌注方面發(fā)揮了重要作用。設(shè)計(jì)初期的一個(gè)常見問題是hChaMP油管連接處的泄漏，盡管添加了GelMA來形成密封。我們發(fā)現(xiàn)，在灌注前，必須在Outi處連接充滿DPBS的油管，以消除表面張力，這種張力會(huì)產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP內(nèi)部的灌注，導(dǎo)致連接處泄漏。再加上Outi相對(duì)于進(jìn)油管尺寸的增加，從本質(zhì)上解決了這個(gè)問題，促進(jìn)了流體通過hChaMP內(nèi)部的流動(dòng)。翻譯生物打印方法的一個(gè)很大的限制是需要大量的細(xì)胞達(dá)到生理密度，當(dāng)工程組織的大小增加到生理尺度時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。允許細(xì)胞在原位增殖減少了對(duì)大量孔板和相應(yīng)的單層擴(kuò)增介質(zhì)體積的需求。在這里，只需要一個(gè)6孔板(1000萬個(gè)hiPSCs)就可以產(chǎn)生厘米級(jí)的hChaMP。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間、打印時(shí)的細(xì)胞密度，或調(diào)整ROCK抑制劑和/或類似的生化化合物處理，可以進(jìn)一步增加分化前的hiPSC密度。增加培養(yǎng)時(shí)間可能會(huì)允許進(jìn)一步的細(xì)胞生長(zhǎng)，但不適合擴(kuò)大規(guī)模和組織應(yīng)用。這也可能進(jìn)一步影響基因表達(dá)。在培養(yǎng)的第7天，多能性和胚層標(biāo)記物在RNA水平上幾乎沒有變化，但灌注的hChaMPs中外胚層標(biāo)記物PAX6略有增加。在蛋白水平上，PAX6未在hChaMPs中表達(dá)。這一結(jié)果與暴露于0.003 - 5 dyn cm - 2剪切應(yīng)力下的小鼠PSCs的研究一致，其中神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)與靜態(tài)培養(yǎng)相當(dāng)[41,42]。與2D培養(yǎng)的hiPSCs相比，灌注的hChaMPs中NANOG RNA表達(dá)也有輕微但不顯著的增加。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于流動(dòng)的小鼠iPSCs中，NANOG和OCT4的表達(dá)也有類似的增加，這可能是由于涉及E-cadherin和/或β-catenin的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。此外，在人類多能干細(xì)胞中，NANOG被認(rèn)為可以抑制外胚層的形成[44]，并通過調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞周期的s期來增加細(xì)胞增殖[45]，這表明NANOG可能在灌注的hChaMPs中發(fā)揮有益作用。因此，需要進(jìn)一步的研究來確定長(zhǎng)時(shí)間灌注對(duì)hiPSCs的影響。生物墨水中的細(xì)胞密度可能會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化以增加菌落數(shù)量，但正如所討論的那樣，這受到用于打印的噴嘴尺寸的限制。另外，用10µM ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾治療多日可提高干細(xì)胞增殖率，s期細(xì)胞比例增加[46]。同樣，類黃酮3,2 ' -二羥黃酮(3,2 ' DHF)已被證明可以增加hiPSCs的增殖、s期細(xì)胞的百分比和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的表達(dá)[47]，這可能在細(xì)胞增殖的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用[48]。與單獨(dú)使用任何一種分子相比，3,2 ' -DHF和Y-27632聯(lián)合處理hiPSCs進(jìn)一步改善了增殖[47]，這表明有希望的方法可以與灌注結(jié)合進(jìn)一步改善細(xì)胞密度和組織厚度。在hChaMP中獲得所需的hiPSC密度后，下一步將是分化。先前的研究表明，在剪切作用下，有可能分化為中胚層[49-52]、內(nèi)胚層[53,54]和外胚層[51,55]。此外，考慮到剪切應(yīng)力在胎兒發(fā)育中的作用[56-59]，仿生血流可能有利于分化組織的功能。然而，在某些分化情況下，高水平的剪切應(yīng)力是有害的。例如，Ting等人發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞分化過程中，在搖椅上持續(xù)攪拌導(dǎo)致心肌細(xì)胞非常少;然而，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，間歇性攪拌可使分化效率提高約38%[49]。同樣，在微載體的肝臟分化中，在分化的早期階段，超過30 rpm的攪拌會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫離微載體[54]。因此，生物反應(yīng)器中的分化參數(shù)需要針對(duì)所需的組織類型進(jìn)行優(yōu)化，以平衡營(yíng)養(yǎng)輸送/廢物清除和維持細(xì)胞健康。作為誘導(dǎo)多系分化進(jìn)展的方法，原位hiPSC增殖的效用可以進(jìn)一步增強(qiáng)[60-65]。這種方法，從不同的支架材料特性到改變細(xì)胞因子或培養(yǎng)基成分以及基因工程hiPSCs，可以很容易地轉(zhuǎn)化為生物打印和生物反應(yīng)器設(shè)置，以獲得大量不同類型的細(xì)胞。分化為多種組織類型，可以研究發(fā)育過程中相關(guān)組織的形成，疾病進(jìn)展中不同組織之間的串?dāng)_，或各種治療方法和劑量對(duì)各種器官的潛在影響。例如，起搏器和心室心肌細(xì)胞的空間分化將極大地增強(qiáng)藥物篩選研究，提供對(duì)給定治療的心律和泵功能的見解。纖維母細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的摻入也可以進(jìn)一步增強(qiáng)仿生功能。
同樣，許多組織工程研究現(xiàn)在都集中在結(jié)合血管的方法上，以增加營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和可能的組織厚度。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)中納入內(nèi)皮細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞類型可能會(huì)導(dǎo)致不必要的旁分泌信號(hào)，從而影響打印組織中干細(xì)胞的多能性或分化效率[66]。在分化為所需的細(xì)胞類型后，內(nèi)皮細(xì)胞可以被納入像我們這樣的模型中，其中灌注可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)皮重要的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[67,68]，并可能誘導(dǎo)血管生成[69]。血管的存在將允許營(yíng)養(yǎng)輸送的增加，從而進(jìn)一步開發(fā)工程組織的效用。
生物3D打印領(lǐng)域的最新發(fā)展極大地?cái)U(kuò)展了創(chuàng)造復(fù)雜的、與生理相關(guān)的體外組織的潛力。當(dāng)這些組織由人類來源的細(xì)胞形成時(shí)，所產(chǎn)生的模型可以提供對(duì)疾病機(jī)制、進(jìn)展和治療的增強(qiáng)研究，作為動(dòng)物模型的補(bǔ)充。在這里，我們利用介質(zhì)灌注和3d生物打印室結(jié)構(gòu)中hipsc的高增殖能力，實(shí)現(xiàn)了生成厚組織模型的目標(biāo)�？偟膩碚f，我們預(yù)計(jì)，隨著該領(lǐng)域在創(chuàng)造更復(fù)雜組織方面的發(fā)展，特別是與正在開發(fā)的工程策略相結(jié)合，這種在這種模型中擴(kuò)展hipsc的能力將是重要的。在該模型中看到的連續(xù)的hipsc集落的形成將允許各種組織類型的原位分化，以便生成具有更高功能和一致性的組織，從而可靠地進(jìn)行體外建模。
數(shù)據(jù)可用性聲明支持本研究結(jié)果的所有數(shù)據(jù)都包含在文章中(以及任何補(bǔ)充文件)。
致謝我們感謝Jeffrey Ai幫助重新設(shè)計(jì)用于灌注的hChaMP結(jié)構(gòu)，Aimee Renaud生成外胚層陽性對(duì)照，Victor Garcia獲得hChaMP、生物反應(yīng)器和裝置的圖像，以及明尼蘇達(dá)大學(xué)實(shí)驗(yàn)外科服務(wù)部門幫助測(cè)量破裂壓力。我們感謝我們的資金來源，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院T32GM008347 (ERK)，R01HL137204 (ERK, WL和BMO)和NIBIB/NIH工程復(fù)雜組織中心P41 EB023833，以及美國(guó)心臟協(xié)會(huì)905669 (ERK)。
參考文獻(xiàn)
[1]Gudapati H, Dey M and Ozbolat I 2016 A comprehensivereview on droplet-based bioprinting: past, present andfuture Biomaterials 102 20–42
[2] Skylar-Scott M A, Uzel S G M, Nam L L, Ahrens J H,Truby R L, Damaraju S and Lewis J A 2019Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellulardensity and embedded vascular channels Sci. Adv. 5 9
[3]Murata D, Arai K and Nakayama K 2020 Scaffold-freebio-3D printing using spheroids as ‘bio-inks’ for tissue(re-)construction and drug response tests Adv. HealthcareMater. 9 1901831
[4] Daly A C, Davidson M D and Burdick J A 2021 3Dbioprinting of high cell-density heterogeneous tissue modelsthrough spheroid fusion within self-healing Nat. Commun.12 1–13
[5] Kupfer M E et al 2020 In situ expansion, differentiation andelectromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3Dbioprinted, chambered organoid Circ. Res. 127 207–24
[6] Ouyang L, Yao R, Mao S, Chen X, Na J and Sun W 2015Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cellsdirects highly uniform embryoid body formationBiofabrication 7 4
[7] Faulkner-Jones A, Fyfe C, Cornelissen D-J, Gardner J, King J,Courtney A and Shu W 2015 Bioprinting of humanpluripotent stem cells and their directed differentiation intohepatocyte-like cells for the generation of mini-livers in 3DBiofabrication 7 4
[8] Ouyang L, Yao R, Zhao Y and Sun W 2016 Effect of bioinkproperties on printability and cell viability for 3Dbioplotting of embryonic stem cells Biofabrication 8 3
[9] Gu Q, Tomaskovic-Crook E, Wallace G G and Crook J M2017 3D bioprinting human induced pluripotent stem cellconstructs for in situ cell proliferation and successivemultilineage differentiation Adv. Healthcare Mater. 6 17
[10] Li Y, Jiang X, Li L, Chen Z-N, Gao G, Yao R and Sun W 20183D printing human induced pluripotent stem cells withnovel hydroxypropyl chitin bioink: scalable expansion anduniform aggregation Biofabrication 10 4
[11] Hamid O A, Eltaher H M, Sottile V and Yang J 2021 3Dbioprinting of a stem cell-laden, multi-material tubularcomposite: an approach for spinal cord repair Mater. Sci.Eng. C 120 111707
[12] Kerscher P, Turnbull I C, Hodge A J, Kim J, Seliktar D,Easley C J, Costa K D and Lipke E A 2016 Direct hydrogelencapsulation of pluripotent stem cells enables ontomimeticdifferentiation and growth of engineered human hearttissues Biomaterials 83 383–95
[13] Gilmozzi V et al 2021 Generation of hiPSC-derivedfunctional dopaminergic neurons in alginate-based 3Dculture Front. Cell Dev. Biol. 9 708389
[14] Gao L et al 2017 Myocardial tissue engineering with cellsderived from human-induced pluripotent stem cells and anative-like, high-resolution, 3-dimensionally printedscaffold Circ. Res. 120 1318–25
[15] Radisic M, Malda J, Epping E, Geng W, Langer R andVunjak-Novakovic G 2006 Oxygen gradients correlate withcell density and cell viability in engineered cardiac tissueBiotechnol. Bioeng. 93 332–43
[16] Ahmed S, Chauhan V M, Ghaemmaghami A M andAylott J W 2018 New generation of bioreactors that advanceextracellular matrix modelling and tissue engineeringBiotechnol. Lett. 41 1–25
[17] Zhang J, Wehrle E, Rubert M and Müller R 2021 3Dbioprinting of human tissues: biofabrication, bioinks, andbioreactors Int. J. Mol. Sci. 22 3971
[18] Adamo L et al 2009 Biomechanical forces promoteembryonic haematopoiesis Nature 459 1131–5
[19] Yamamoto K, Sokabe T, Watabe T, Miyazono K,Yamashita J K, Obi S, Ohura N, Matsushita A, Kamiya A andAndo J 2005 Fluid shear stress induces differentiation ofFlk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelialcells in vitro Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 288 H1915–24
[20] Ahsan T and Nerem R M 2010 Fluid shear stress promotesan endothelial-like phenotype during the earlydifferentiation of embryonic stem cells Tissue Eng. A 16 3547
[21] Greuel S, Freyer N, Hanci G, Böhme M, Miki T, Werner J,Schubert F, Sittinger M, Zeilinger K and Mandenius C-F2019 Online measurement of oxygen enables continuousnoninvasive evaluation of human-induced pluripotent stemcell (hiPSC) culture in a perfused 3D hollow-fiber bioreactorJ. Tissue Eng. Regen. Med. 13 1203–16
[22] Fattahi P et al 2021 Core–shell hydrogel microcapsulesenable formation of human pluripotent stem cell spheroidsand their cultivation in a stirred bioreactor Sci. Rep.11 1–13
[23] Isidro I A et al 2021 Online monitoring of hiPSC expansionand hepatic differentiation in 3D culture by dielectricspectroscopy Biotechnol. Bioeng. 118 3610–7
[24] Borys B S et al 2021 Overcoming bioprocess bottlenecks inthe large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates invertical-wheel stirred suspension bioreactors Stem Cell Res.Ther. 12 1–19
[25] Nogueira D E S, Rodrigues C A V, Carvalho M S,Miranda C C, Hashimura Y, Jung S, Lee B and Cabral J M S2019 Strategies for the expansion of human inducedpluripotent stem cells as aggregates in single-useVertical-WheelTM bioreactors J. Biol. Eng. 13 74
[26] Zhu W, Zhao M, Mattapally S, Chen S and Zhang J 2018CCND2 overexpression enhances the regenerative potency ofhuman induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes: remuscularization of injured ventricle Circ.Res. 122 88–96
[27] Lee A, Hudson A R, Shiwarski D J, Tashman J W, Hinton T J,Yerneni S, Bliley J M, Campbell P G and Feinberg A W 20193D bioprinting of collagen to rebuild components of thehuman heart Science 365 482–7
[28] Figueroa C A, Vignon-Clementel I E, Jansen K E,Hughes T J R and Taylor C A 2006 A coupled momentummethod for modeling blood flow in three-dimensionaldeformable arteries Comput. Methods Appl. Mech. Eng.195 5685–706
[29] Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S andMadden T L 2012 Primer-BLAST: a tool to designtarget-specific primers for polymerase chain reaction BMCBioinform. 13 134
[30] Kung E O, Les A S, Figueroa C A, Medina F, Arcaute K,Wicker R B, McConnell M V and Taylor C A 2011 In vitrovalidation of finite element analysis of blood flow indeformable models Ann. Biomed. Eng. 39 1947–60
[31] Bonfanti M, Franzetti G, Homer-Vanniasinkam S,Díaz-Zuccarini V and Balabani S 2020 A combined in vivo, invitro, in silico approach for patient-specific haemodynamicstudies of aortic dissection Ann. Biomed. Eng. 48 2950–64
[32] Sargent C Y, Berguig G Y, Kinney M A, Hiatt L A,Carpenedo R L, Berson R E and McDevitt T C 2010Hydrodynamic modulation of embryonic stem celldifferentiation by rotary orbital suspension cultureBiotechnol. Bioeng. 105 611–26
[33] Wang Y, Chou B K, Dowey S, He C, Gerecht S and Cheng L2013 Scalable expansion of human induced pluripotentstem cells in the defined xeno-free E8 medium underadherent and suspension culture conditions Stem Cell Res.11 1103–16
[34] Ismadi M Z, Gupta P, Fouras A, Verma P, Jadhav S, Bellare Jand Hourigan K 2014 Flow characterization of a spinnerflask for induced pluripotent stem cell culture applicationPLoS One 9 e106493
[35] Farzaneh M 2021 Concise review; effects of antibiotics andantimycotics on the biological properties of humanpluripotent and multipotent stem cells Curr. Stem Cell Res.Ther. 16 400–5
[36] Carrier R L, Rupnick M, Langer R, Schoen F J, Freed L E andVunjak-Novakovic G 2002 Perfusion improves tissuearchitecture of engineered cardiac muscle Tissue Eng.8 175–88
[37] Radisic M, Yang L, Boublik J, Cohen R J, Langer R, Freed L Eand Vunjak-Novakovic G 2004 Medium perfusion enablesengineering of compact and contractile cardiac tissue Am. J.Physiol.—Heart Circ. Physiol. 286 507–16
[38] Dahlin R L, Meretoja V V, Ni M, Kasper F K and Mikos A G2012 Design of a high-throughput flow perfusion bioreactorsystem for tissue engineering Tissue Eng. C 18 817–20
[39] Gabetti S et al 2022 An automated 3D-printed perfusionbioreactor combinable with pulsed electromagnetic fieldstimulators for bone tissue investigations Sci. Rep. 12 13859
[40] Yamada S, Yassin M A, Schwarz T, Mustafa K andHansmann J 2022 Optimization and validation of acustom-designed perfusion bioreactor for bone tissueengineering: flow assessment and optimal cultureenvironmental conditions Front. Bioeng. Biotechnol.10 811942
[41] Nsiah B A, Ahsan T, Griffiths S, Cooke M, Nerem R M andMcDevitt T C 2014 Fluid shear stress pre-conditioningpromotes endothelial morphogenesis of embryonic stemcells within embryoid bodies Tissue Eng. A 20 954–65
[42] Blagovic K, Kim L Y and Voldman J 2011 Microfluidicperfusion for regulating diffusible signaling in stem cellsPLoS One 6 8
[43] Nath S C, Day B, Harper L, Yee J, Hsu C Y-M, Larijani L,Rohani L, Duan N, Kallos M S and Rancourt D E 2021 Fluidshear stress promotes embryonic stem cell pluripotency viainterplay between β-catenin and vinculin in bioreactorculture Stem Cells 39 1166–77
[44] Wang Z, Oron E, Nelson B, Razis S and Ivanova N 2012Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, andSOX2 in human embryonic stem cells Cell Stem Cell10 440–54
[45] Zhang X et al 2009 A role for NANOG in G1 to S transitionin human embryonic stem cells through direct binding ofCDK6 and CDC25A J. Cell Biol. 184 67
[46] Watanabe K et al 2007 A ROCK inhibitor permits survival ofdissociated human embryonic stem cells Nat. Biotechnol.25 681–6
[47] Kim K et al 2020 3,2′ -Dihydroxyflavone improves theproliferation and survival of human pluripotent stem cellsand their differentiation into hematopoietic progenitor cellsJ. Clin. Med. 9 3
[48] Pallardó F V, Markovic J, García J L and Vi˜na J 2009 Role ofnuclear glutathione as a key regulator of cell proliferationMol. Aspects Med. 30 77–85
[49] Ting S, Chen A, Reuveny S and Oh S 2014 An intermittentrocking platform for integrated expansion anddifferentiation of human pluripotent stem cells tocardiomyocytes in suspended microcarrier cultures Stem CellRes. 13 202–13
[50] Correia C et al 2014 Combining hypoxia and bioreactorhydrodynamics boosts induced pluripotent stem celldifferentiation towards cardiomyocytes Stem Cell Rev. Rep.10 786–801
[51] Badenes S M, Fernandes T G, Cordeiro C S M, Boucher S,Kuninger D, Vemuri M C, Diogo M M and Cabral J M S2016 Defined essential 8TM medium and vitronectinefficiently support scalable xeno-free expansion of humaninduced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culturesystems PLoS One 11 e0151264
[52] Ackermann M et al 2018 Bioreactor-based mass productionof human iPSC-derived macrophages enablesimmunotherapies against bacterial airway infections Nat.Commun. 9 1–13
[53] Lock L T and Tzanakakis E S 2009 Expansion anddifferentiation of human embryonic stem cells to endodermprogeny in a microcarrier stirred-suspension culture TissueEng. A 15 2051–63
[54] Park Y, Chen Y, Ordovas L and Verfaillie C M 2014 Hepaticdifferentiation of human embryonic stem cells onmicrocarriers J. Biotechnol. 174 39–48
[55] Qiu L, Lim Y M, Chen A K, Reuveny S, Oh S K W, Tan E Kand Zeng L 2016 Microcarrier-expanded neural progenitorcells can survive, differentiate, and innervate host neuronsbetter when transplanted as aggregates Cell Transplant.25 1343–57
[56] Hove J R, Köster R W, Forouhar A S, Acevedo-Bolton G,Fraser S E and Gharib M 2003 Intracardiac fluid forces arean essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesisNature 421 172–7
[57] Courchaine K, Rykiel G and Rugonyi S 2018 Influence ofblood flow on cardiac development Prog. Biophys. Mol. Biol.137 95
[58] Conrad L et al 2021 The biomechanical basis of biasedepithelial tube elongation in lung and kidney developmentDevelopment 148 9
[59] Lorenz L et al 2018 Mechanosensing by β1 integrin inducesangiocrine signals for liver growth and survival Nature562 128–32
[60] Ng W H et al 2022 Recapitulating human cardio-pulmonaryco-development using simultaneous multilineagedifferentiation of pluripotent stem cells eLife 11 e67872
[61] Skylar-Scott M A, Huang J Y, Lu A, Ng A H M, Duenki T,Liu S, Nam L L, Damaraju S, Church G M and Lewis J A2022 Orthogonally induced differentiation of stem cells forthe programmatic patterning of vascularized organoids andbioprinted tissues Nat. Biomed. Eng. 6 449–62
[62] Giacomelli E, Bellin M, Sala L, van Meer B J, Tertoolen L G J,Orlova V V and Mummery C L 2017 Three-dimensionalcardiac microtissues composed of cardiomyocytes andendothelial cells co-differentiated from human pluripotentstem cells Development 144 1008–17
[63] Wu F, Wu D, Ren Y, Huang Y, Feng B, Zhao N, Zhang T,Chen X, Chen S and Xu A 2019 Generation of hepatobiliaryorganoids from human induced pluripotent stem cells J.Hepatol. 70 1145–58
[64] Jin G, Floy M E, Simmons A D, Arthur M M and Palecek S P2021 Spatial stem cell fate engineering via facile morphogenlocalization Adv. Healthcare Mater. 10 2100995
[65] Kilian D, Cometta S, Bernhardt A, Taymour R, Golde J,Ahlfeld T, Emmermacher J, Gelinsky M and Lode A 2022Core-shell bioprinting as a strategy to apply differentiationfactors in a spatially defined manner inside osteochondraltissue substitutes Biofabrication 14 1
[66] Freyer N, Greuel S, Knöspel F, Strahl N, Amini L, Jacobs F,Monshouwer M and Zeilinger K 2017 Effects of co-culturemedia on hepatic differentiation of hiPSC with or withoutHUVEC co-culture Int. J. Mol. Sci. 18 1724
[67] Davies P F 2009 Hemodynamic shear stress and theendothelium in cardiovascular pathophysiology Nat. Clin.Pract. Cardiovasc. Med. 6 16–26
[68] Kinstlinger I S, Calderon G A, Royse M K, Means A K,Grigoryan B and Miller J S 2021 Perfusion andendothelialization of engineered tissues with patternedvascular networks Nat. Protocols 16 3089–113
[69] Galie P A, Nguyen D H T, Choi C K, Cohen D M, Janmey P Aand Chen C S 2014 Fluid shear stress threshold regulatesangiogenic sprouting Proc. Natl Acad. Sci. USA 111 7968–73
隨著3D生物打印和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的出現(xiàn)，組織工程領(lǐng)域發(fā)展迅速，但由于缺乏功能豐富的厚組織，影響有限。繞過這一限制的方法之一是用含有 hiPSCs 的3D 生物打印組織。通過這種方式，iPSCs可以在實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化之前增殖并填充厚組織塊。在這里,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)灌注生物反應(yīng)器，用于裝載hipsc的3d生物打印室， 目的是在分化之前在 整個(gè)結(jié)構(gòu)中增殖hipsc，以產(chǎn)生厚組織模型。生物反應(yīng)器由數(shù)字光投影制成，經(jīng)過優(yōu)化，可 以在水凝膠室內(nèi)部灌注而不會(huì)泄漏，也可以在外部提供流體流動(dòng)，從而最大限度地提高整 個(gè)室壁的營(yíng)養(yǎng)輸送。經(jīng)過7天的培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)在3ml min-1下間歇灌注(每15分鐘15秒)，相 對(duì)于在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的類似腔室，工程組織中的干細(xì)胞集落密度增加了1.9倍。我們還觀 察到，相對(duì)于靜態(tài)對(duì)照，灌注結(jié)構(gòu)的組織壁內(nèi)的菌落分布更均勻，反映了培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的均勻分布。在流體流動(dòng)的作用下，hiPSCs保持多能性和增殖性，產(chǎn)生平均約1.0 dyncm-2 的壁剪切應(yīng)力�？偟膩碚f，這些充滿希望的結(jié)果在灌注干細(xì)胞水凝膠后支持多種組織類 型的產(chǎn)生，并改善了厚度，因此增加了功能和實(shí)用性。
1. 介紹
三維（3D）生物打印技術(shù)為創(chuàng)建人體疾病模 型提供了巨大的潛力，可以在體外對(duì)疾病機(jī)制、 進(jìn)展和治療進(jìn)行器官級(jí)研究。生物打印還可以生 成功能性替代組織，用于治療各種疾病。然而， 人體每個(gè)器官都有數(shù)十億個(gè)細(xì)胞，要獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞來創(chuàng)建具有代表性的體外組織并非易事 。雖然擠壓生物打印的細(xì)胞密度通常高于其他打 印方式，但目前通常只能達(dá)到每毫升生物墨水?dāng)?shù) 千萬個(gè)細(xì)胞的規(guī)模[1]。目前正在開發(fā)使用球體 或胚狀體進(jìn)行無支架生物打印的方法[2-4]，從而提高打印組織的細(xì)胞密度。然而，除了自身的一系列局限性（包括球形變異性、可打印性和打印分辨率方面的挑戰(zhàn)）外，這些方法仍然需要細(xì)胞放大和大容量培養(yǎng)基才能達(dá)到生理密度。為了解決工程組織中細(xì)胞密度低的問題，人們引入了原位干細(xì)胞擴(kuò)增和分化的生物打印方法[5-11]。在這種方法中，被打印在生物墨水中的是干細(xì)胞而不是實(shí)質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞在分化成所需細(xì)胞類型之前，可在工程組織中擴(kuò)增。這對(duì)涉及增殖或遷移能力有限的細(xì)胞類型（如心肌細(xì)胞）的應(yīng)用尤其有益，也可作為使用源自患者的原始細(xì)胞的替代方法[5, 12, 13]。這種方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在分化過程中形成的關(guān)鍵細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和 ECM-ECM 連接可以保持不變，不會(huì)被破壞。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)?ECM 組織對(duì)工程心臟組織的功能至關(guān)重要[14]。此外，在原位分化過程中形成并保存在三維生物打印結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境可實(shí)現(xiàn)人腔肌泵（hChaMP）的組織和心臟功能[5]。使用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）打印的hChaMP 是由一種生物墨水生成的，這種墨水含有專門針對(duì) hiPSC 生長(zhǎng)和分化為心肌細(xì)胞而優(yōu)化的 ECM。hiPSCs 在心肌細(xì)胞分化前增殖兩周，從而使結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞密度更符合生理要求。因此，hChaMP 在整個(gè)結(jié)構(gòu)中顯示出連續(xù)的肌肉功能，這一點(diǎn)可以通過光學(xué)繪圖和肌肉組織每次收縮時(shí)泵送液體的能力來證明。然而，雖然使用干細(xì)胞進(jìn)行生物打印以及隨后的擴(kuò)增和分化是一項(xiàng)很有前景的技術(shù)，但由于營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，hChaMP顯示出有限的組織厚度[5]，這是組織工程領(lǐng)域眾所周知的問題。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（尤其是氧氣）的供應(yīng)限制了工程組織的厚度，通常只能達(dá)到 100-200 微米的存活組織[15]。然而，有了流體流動(dòng)，就可以通過對(duì)流擴(kuò)大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取，從而開發(fā)出許多用于工程組織的生物反應(yīng)器[16, 17]。由于多能干細(xì)胞對(duì)微環(huán)境敏感，而剪切應(yīng)力已被證明可誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞造血[18]，并促進(jìn)干細(xì)胞衍生前體形成內(nèi)皮細(xì)胞[19, 20]，因此在工程組織中對(duì)流擴(kuò)增hiPSC可能會(huì)誘發(fā)無意分化。相反，許多生物反應(yīng)器研究表明，利用流體力學(xué)擴(kuò)增干細(xì)胞聚集體或微載體，其效力損失有限[21-25]。在此，我們介紹了為hChaMP開發(fā)的灌注生物反應(yīng)器。我們的研究表明，間歇灌注hChaMP可使細(xì)胞密度在培養(yǎng)一周后增加近兩倍。
此外，盡管暴露在剪切應(yīng)力下，hiPSCs仍能保持多能性，而剪切應(yīng)力近似低于其他常見的干細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器。這些結(jié)果表明，擴(kuò)增的iPSCs分化成所需細(xì)胞類型后，有望生成厚組織模型。
2. 材料與方法
2.1. hChaMP制造
通過Autodesk Meshmixer和Blender（圖1(a)），根據(jù)之前報(bào)道的結(jié)構(gòu)[5]重新設(shè)計(jì)了hChaMPs ，并在Slic3r中生成了g代碼。打印前一天，在含有 75% mTeSR1（STEMCELLTechnologies，cat#85850）、25% 醋酸（20 mM）和1.3% 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（LAP，Allevi）的溶液中，將甲基丙烯酰明膠（GelMA；明尼蘇達(dá)大學(xué)生物打印設(shè)備）在60℃下重組至 26.7% w/v。甲基丙烯酸膠原（ColMA；Advanced Biomatrix，cat#5198）在 20 µM乙酸中溶解至2% w/v，溫度為37℃。打印前，混合GelMA和ColMA溶液（3:1 GelMA溶液：ColMA溶液，即 20% w/v GelMA，0.5% w/v ColMA），并用1M 氫氧化鈉中和。這些研究中使用了 hiPSCs（在肌球蛋白重鏈基因[26]下過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白 D2，雌性）。hiPSCs 在 基底膜基質(zhì)（Corning，cat#08-774-552）上的 mTeSR1 中保存，并通過 ReLeSR（STEMCELL Technologies，cat#05872）定期傳代。打印時(shí)，用細(xì)胞消化液（Millipore Sigma，cat#A6964）將匯合度為 60%-80% 的 hiPSCs單個(gè)化。細(xì)胞懸浮液清洗后離心兩次，以除去可能降解基質(zhì)支架的多余細(xì)胞消化液。然后將細(xì)胞以 3000 萬個(gè)細(xì)胞 ml-1 的量重懸在 ECM 溶液中，該溶液含有 187 µg ml-1 小鼠層粘連蛋白/腸粘連蛋白（LN；Corning，cat#354259）、187µg ml-1 人纖連蛋白（FN；Corning，cat#356008 或 R&D systems，cat#1918-FN-02M）和10 µM Y-27632 ROCK 抑制劑（Selleckchem，cat#S1049）的 mTeSR1，并在室溫下孵育 15 分鐘。hChaMPs 在INKREDIBLE擠壓式生物打印機(jī)（CELLINK）上打印。為了提高低粘度生物墨水的分辨率，打印是在基于 FRESH v2.0[27]的支撐浴中進(jìn)行的。支撐浴是在生物安全柜中制作的，以保持無菌狀態(tài)；52.5%的無菌Milli-Q水和47.5%的乙醇混合物在輔助容器中制作的水浴中加熱到45℃。以每分鐘400轉(zhuǎn)的速度攪拌混合物，并用鋁箔覆蓋以減少蒸發(fā)。加入氫氧化鈉（1mM）使pH值升至7，然后加入B型明膠（SigmaAldrich，cat#G9382，2% w/v）和阿拉伯樹膠（Sigma Aldrich，cat#9752，1% w/v）。溶液在45℃下混合10分鐘，然后冷卻至35℃，然后緩慢冷卻至25℃(<1℃ min-1)。然后降低溫度至10℃，再攪拌5分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移到錐形管中，在100G下離心4分鐘。將上清替換為冷的、無菌的Milli-Q水，管子旋轉(zhuǎn)，在500G下離心5分鐘。然后用冷的、無菌的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;Fisher Scientific, cat#BP3994)，并保存在4℃，直到打印當(dāng)天。此時(shí)，在1200G下離心3分鐘，去除多余的PBS，薄層紫外線照射30分鐘。生物墨水在27°C下用27 G, 1英寸針頭打印。如前所述[5]，為了保持打印結(jié)構(gòu)的一致性(這對(duì)灌注設(shè)置很重要)，壓力根據(jù)針頭的墨水滴速而變化。對(duì)于給定的打印結(jié)構(gòu)，這里使用的墨水，滴針之間的滴速為3.1秒。在六個(gè)面各打印20秒后，墨水與藍(lán)光(405 nm)交聯(lián)。然后將支撐液中的打印物移到培養(yǎng)箱中熔化支撐液，然后用溫暖、無菌的Dulbecco PBS (DPBS;不含Ca2+和Mg2+;Thermo Fisher Scientific，編號(hào)14190144)。hChaMPs在5µM Y-27632的mTeSR1中培養(yǎng)過夜，在靜態(tài)條件下允許細(xì)胞附著。
該設(shè)計(jì)允許灌注hChaMP 內(nèi)部(實(shí)箭頭),以及圍繞hChaMP 外部的流體流動(dòng)(虛線箭頭)。hChaMP 輕輕放置在細(xì)水平桿上 ,允許在hChaMP底部周圍進(jìn)行外部灌注。(d)3d 打印生物反應(yīng)器，由螺母、螺栓和硅膠墊圈組裝而成。(e)生物反應(yīng)器 中的hChaMP。油管將hChaMP連接到生物反應(yīng)器。(f)整個(gè)灌注裝置，生物反應(yīng)器連接到泵和介質(zhì)儲(chǔ)存器。
2.2. hChaMP 灌注
在SOLIDWORKS中設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器，其中hChaMP內(nèi)部灌注端口(Ini和Outi)和hChaMP外部流動(dòng)端口(Ine和Oute)(圖1(c))。生物反應(yīng)器通過Perfactory IV數(shù)字光投影打印機(jī)(EnvisionTEC)使用E-shell 300 (EnvisionTEC,cat#1500300)進(jìn)行3d打印(圖1(d))。灌注時(shí)，使用Masterflex L/S標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字驅(qū)動(dòng)器(cat#07522-30)與Masterflex L/S 14鉑固化硅膠管(1.6 mm ID, cat#96410-14)。培養(yǎng)基儲(chǔ)液器是一個(gè)50 ml的錐形管，蓋子上有三個(gè)孔，兩個(gè)用于流體的進(jìn)出口，一個(gè)用于0.22µm注射器過濾器(Whatman, cat#6780-2502)，允許在培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌氧氣交換。培養(yǎng)基儲(chǔ)層最初填充兩倍體積的培養(yǎng)基(mTeSR Plus [STEMCELLTechnologies, cat#100-0276])，并添加100 μml - 1青霉素，100 μ ml - 1鏈霉素[penp -strep;Thermo Fisher Scientific, cat#15140122]用于灌注的第一天)，而不是管道和生物反應(yīng)器中所需的系統(tǒng)。這樣，在隨后的日子里，只需簡(jiǎn)單地更換錐形管，就可以更換 50%的培養(yǎng)基（mTeSR Plus，no pen-strep），從而最大限度地減少排空管道時(shí)可能發(fā)生的污染和氣泡形成。靜態(tài)對(duì)照在具有等量培養(yǎng)基的立式T25燒瓶中培養(yǎng)，每天也更換50%的培養(yǎng)基。
打印1天后開始灌注。生物反應(yīng)器在生物安全柜中紫外線照射下，70%乙醇浸泡30分鐘滅菌。然后用無菌的1X PBS洗滌生物反應(yīng)器三次。為了準(zhǔn)備hChaMP進(jìn)行灌注(圖S1)，將hChaMP移至有溫DPBS的培養(yǎng)皿中。硅膠管(15mm長(zhǎng)，2mm內(nèi)徑，3mm外徑;將uxcell (cat#a19011600ux0295)插入hChaMP的兩條血管中。將插入管的hChaMP移至干凈、干燥的培養(yǎng)皿中，在管和hChaMP的界面處移液無菌的20% GelMA(含0.5% w/v LAP，如上所述溶解于mTeSR1和乙酸中)，同時(shí)用藍(lán)光交聯(lián)。將hChaMP移動(dòng)到充滿DPBS的生物反應(yīng)器中，使用無菌細(xì)齒鉗將管的另一端插入生物反應(yīng)器通道中(圖1(e))。20%的GelMA被添加到每根油管的兩端，以形成防止泄漏的密封。Outi的管(Masterflex C-Flex管，3.2 mm ID，編號(hào)06422-04)充滿DPBS，并連接到生物反應(yīng)器上，以消除Outi的表面張力，這種張力會(huì)產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP的灌注。為了檢查內(nèi)部灌注是否有泄漏，用食用色素染色的DPBS(通過0.22µm過濾器過濾)用注射器和針頭注射到Ini。如果油管連接處存在泄漏，則使用20%以上的GelMA。染色的DPBS用mTeSR Plus溫水沖洗。然后將生物反應(yīng)器連接到灌注裝置上。將生物反應(yīng)器連接到引管上，在生物反應(yīng)器上放置30mm硅膠墊片，并用螺母和螺栓固定生物反應(yīng)器蓋。將泵打開至3ml min - 1，以去除生物反應(yīng)器中剩余的空氣。將灌注設(shè)置(圖1(f))移至培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)，并將流量改為間歇，每15分鐘以3ml min - 1的速度流動(dòng)15 s。每天進(jìn)行50%的介質(zhì)更換，直到灌注結(jié)束。
2.3. 計(jì)算模擬
為了建立 hChaMP 中流體流動(dòng)的計(jì)算模型，在生物反應(yīng)器的入口和出口處測(cè)量了流動(dòng)下的壓力。簡(jiǎn)言之，如上所述，將無細(xì)胞 hChaMP 插入生物反應(yīng)器并連接流動(dòng)。在生物反應(yīng)器入口或出口的底部放置止血閥（Qosina，cat#80395），以便在設(shè)置中插入壓力導(dǎo)管。使用 ADV500 PV系統(tǒng)和 1.4 Fr 壓力導(dǎo)管（Transonic）測(cè)量壓力曲線，數(shù)據(jù)采集采樣率為 5000 Hz。在Simvascular中使用流固相互作用(FSI)方法來解析內(nèi)部流動(dòng)[28]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用彈性模量為1.96 kPa的新hookean模型來描述墻。流體模型采用牛頓流體模型，粘度為1 cP，用波形描述進(jìn)口的間歇流動(dòng)，并在出口施加與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相匹配的壓力作為邊界條件。為了穩(wěn)定系統(tǒng)中的壓力，在明尼蘇達(dá)超級(jí)計(jì)算研究所進(jìn)行了十個(gè)周期的模擬。外部流動(dòng)使用Ansys Fluent, release 20.1進(jìn)行求解，假設(shè)墻壁是剛性的。與內(nèi)部流動(dòng)模擬一樣，將流體描述為粘度為1 cP的牛頓流體，并施加一個(gè)波形作為進(jìn)口邊界條件，其流量與內(nèi)部流動(dòng)模擬的出口結(jié)果相匹配。出口設(shè)為零參考?jí)毫Α?br />
2.4.冷凍切片和免疫熒光(IF)染色
培養(yǎng)7天后，去除hChaMP底部(頂端)進(jìn)行核糖核酸(RNA)提取(見下文)。剩余的hChaMP在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜。第二天，hChaMPs用1X PBS洗滌三次。hChaMP腔室(在血管和切除的頂點(diǎn)之間)被切成兩部分，以便從結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域進(jìn)行切片。切片前，樣品在30% w/v蔗糖的PBS中4?C孵育2 d。為了準(zhǔn)備冷凍樣品，將樣品移動(dòng)到30%蔗糖:O.C.T.的1:1混合物中化合物(Tissue-Tek，編號(hào)25608-930)孵育1.5小時(shí)，然后在O.C.T.化合物中低溫模孵育3小時(shí)。然后將樣品在-80℃下冷凍。使用徠卡CM1900低溫恒溫器對(duì)樣品進(jìn)行10µm厚度的切片。將載玻片置于室溫下過夜，第二天使用或移至- 20℃。為了通過hChaMP成像細(xì)胞分布，切片用5µg ml?1 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen, cat#D1306)染色8分鐘，然后用DAPI/1,4-重氮雜環(huán)[2,2,2]辛烷(DABCO;Sigma-Aldrich, cat#D27802)在甘油和PBS。在徠卡DMi8熒光顯微鏡下，將載玻片成像為瓦片。為了量化ImageJ中的菌落密度，使用瓦片掃描明場(chǎng)圖像跟蹤切片的邊緣，將dapi標(biāo)記的瓦片掃描進(jìn)行二值化，并使用Analyze Particles功能識(shí)別大于或等于1000µm2的細(xì)胞菌落。每個(gè)hChaMP分析了5個(gè)切片。通過在明場(chǎng)切片(菌落不容易可視化的地方)上沿著每個(gè)切片的厚度(從室外到室內(nèi))繪制10條線來定量分布，然后沿著每條線找到二值化DAPI的Plot Profile。在Microsoft Excel中分析剖面，以確定在組織厚度的每五分之一段內(nèi)發(fā)生的情況。平均壁厚計(jì)算為所有線的平均長(zhǎng)度。對(duì)于IF，用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat#T8787)滲透1小時(shí)，用5%牛血清白蛋白、1%甘氨酸、2%山羊血清和0.1% Triton X-100 (BGST)的溶液阻斷2小時(shí)。在BGST中，一級(jí)抗體(1µg ml-1小鼠anti-OCT3/4 [Santa CruzBiotechnology, cat#sc-5279]， 5µg ml-1小鼠anti-KI67 [BD Biosciences, cat#556003]，和2.5µg ml-1兔 anti-PAX6 [Invitrogen, cat#42-6600]，圖S2)在4℃下在切片上孵育過夜。在次級(jí)抗體(4µg ml-1 AlexaFluor 647羊 anti-mouse[Invitrogen, cat#A21236]或AlexaFluor 647羊anti-rabbit [Invitrogen, cat#A32733])中孵育2小時(shí)前，用0.2% Tween-20 (Millipore, cat#655204)在1XPBS中洗滌2次，用1XPBS洗滌1次。樣品再次用Tween-20和PBS洗滌，然后用DAPI染色，并如上所述用DAPI/DABCO涂載。采集菌落20×圖像，在ImageJ中定量熒光標(biāo)記面積。具體來說，DAPI圖像是二值化的，并且使用AnalyzeParticles特征來跟蹤集落邊界，作為集落小于1000µm2的感興趣區(qū)域(roi)。然后對(duì)相應(yīng)的IF圖像進(jìn)行二值化處理，將每個(gè)ROI內(nèi)標(biāo)記物覆蓋的面積量化歸一化為相應(yīng)ROI內(nèi)的DAPI密度。對(duì)于每個(gè)標(biāo)記，每個(gè)hChaMP分析了>30個(gè)菌落。
2.5. RT-qPCR
用刀片輕輕去除hChaMPs的頂端，并在液氮罐中快速冷凍，以備將來提取RNA。樣品裂解并使用PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen，編號(hào)12183018A)分離RNA。使用Gen5軟件在Cytation3成像閱讀器(BioTek)上定量RNA的質(zhì)量和數(shù)量。cDNA使用SuperScript IV VILO MasterMix (Invitrogen, cat#11756050)根據(jù)制造商的說明創(chuàng)建。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)使用PowerSYBR Green Master Mix (1X,Applied Biosystems, cat#4367659)在RocheLightCycler 96(多能性標(biāo)記，60°C退火)或Eppendorf Mastercycler ep realplex2(胚層標(biāo)記，55°C退火)上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。標(biāo)記物的表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。引物序列來源于文獻(xiàn)(Integrated DNA Technologies，表S1)，并根據(jù)primer-blast[29]中所關(guān)注基因的特異性和低二聚化可能性，根據(jù)Integrated DNATechnologies 的 OligoAnalyzer Tool 選擇引物對(duì)。陽性對(duì)照的hipsc衍生的胚層組織如補(bǔ)充信息中所述。
2.6. 統(tǒng)計(jì)
每種情況下測(cè)試三個(gè)hChaMPs。在JMP Pro16.0中進(jìn)行樣本組比較。對(duì)不相等均值(雙尾)的零假設(shè)計(jì)算p值，置信區(qū)間為95%。采用學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算靜態(tài)和灌注hChaMPs的p值，而RT-qPCR的多個(gè)條件采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)和事后Tukey-Kramer誠(chéng)實(shí)顯著性差異(HSD)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
3. 結(jié)果
3.1. 生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與灌注參數(shù)的選擇為灌注設(shè)計(jì)的hChaMP結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示(視頻S1)。該結(jié)構(gòu)在先前報(bào)道的結(jié)構(gòu)[5]基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，作為單個(gè)心室，允許未來通過施加流體流動(dòng)和機(jī)械閥驅(qū)動(dòng)來建模心室功能(即泵送)。hChaMP是通過擠壓打印的生物打印(圖1(b))，由含有hiPSCs(1500萬ml - 1細(xì)胞)、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、甲基丙烯化膠原蛋白、層粘連蛋白/腸動(dòng)蛋白和纖維連接蛋白的生物墨水形成。由于ecm支架的微妙性質(zhì)，其存儲(chǔ)模量為1.79±0.13 kPa(圖S3)，因此設(shè)計(jì)了一個(gè)生物反應(yīng)器來支持hChaMP在整個(gè)灌注過程中(圖1(c) - (e))。短管被用作hChaMP和生物反應(yīng)器之間的連接。將管插入hChaMP中，在連接處加入無菌的20%GelMA并光交聯(lián)以將管密封到位。該生物反應(yīng)器包含一個(gè)隔間，用于穩(wěn)定定位hChaMP，并具有兩個(gè)通道，用于插入連接到hChaMP的管道。生物反應(yīng)器被設(shè)計(jì)成適當(dāng)?shù)匾龑?dǎo)流體通過hChaMP的內(nèi)部，然后繞過外部(圖1(c)和視頻S2-S3)，以最大限度地實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)交換。為了減少通過hChaMP的流體阻力，Outi比Ini大。從Outi流出的水流流入Ine, Ine進(jìn)入hChaMP下方的生物反應(yīng)器隔間，并從hChaMP上方的蓋子流出Oute(圖1(c)和視頻S3)。在完成提供內(nèi)部和外部流動(dòng)的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)后，考慮灌注流速。每30-60分鐘灌注1分鐘，這種不頻繁的灌注方式導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)很少，可能是由于生物反應(yīng)器和hChaMP內(nèi)缺乏氧氣交換以及廢物去除有限。因此，采用每15分鐘15 s的間歇灌注。這種流動(dòng)的持續(xù)時(shí)間允許在hChaMP內(nèi)部完全改變介質(zhì)，并且頻率支持組織內(nèi)的細(xì)胞存活。
圖2所示。流體流動(dòng)特性。(a)，(b)通過顆粒跟蹤(a)和計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)(b)總結(jié)了hChaMP腔室的流動(dòng)模式。(c)計(jì)算模型提供了灌注對(duì)hChaMP內(nèi)壁速度、壓力和壁面剪切應(yīng)力的影響。(d) hChaMP外部的流動(dòng)概況，用藍(lán)色食用色素染色的DPBS進(jìn)行演示。相對(duì)于流經(jīng)hChaMP內(nèi)部的流體，外部的流體流動(dòng)速度較慢。(e) hChaMP外周流場(chǎng)計(jì)算模型。(f)由外部流體流動(dòng)引起的壓力和壁面剪應(yīng)力的計(jì)算近似值(此處流動(dòng)方向?yàn)閺淖蟮接?。
值得注意的是，在生物反應(yīng)器中對(duì)hChaMP施加壓力增加的情況下，泄漏將持續(xù)發(fā)生在管道-hChaMP界面。這種壓力限制限制了該模型在下游應(yīng)用中的實(shí)用性，因?yàn)楫?dāng)接口處存在泄漏時(shí)，hChaMP無法達(dá)到更高的壓力。因此，我們探索了提高軟組織對(duì)疏水管粘附性的方法。經(jīng)3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯預(yù)處理(補(bǔ)充方法，圖S5(a))，油管與添加在油管- hchamp界面的GelMA的結(jié)合得到改善。這使得界面可以承受更高的壓力，hChaMP本身在破裂前的最大壓力達(dá)到16.8±0.6 mmHg(圖S5(b)， (c)和視頻S4)。這是系統(tǒng)使用蠕動(dòng)泵(~ 8.2 mmHg)時(shí)的平均壓力的兩倍。然而，這個(gè)最大壓力或“爆裂”壓力被發(fā)現(xiàn)低于蠕動(dòng)泵施加的最大壓力(~ 27.1 mmHg)。這種差異可歸因于蠕動(dòng)泵的振蕩壓力，其中低壓和高壓的快速波動(dòng)導(dǎo)致hChaMP的膨脹和收縮(視頻S3)。在爆炸試驗(yàn)中，壓力被緩慢地直接施加到hChaMP壁上，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不斷膨脹(圖S5(b)和視頻S4)，直到壁上變得太弱而無法容納更多的流體。
3.2. 流體流動(dòng)參數(shù)的近似值
為了近似計(jì)算流體流動(dòng)對(duì)hChaMP的影響，特別是在hChaMP壁面處的壓力和剪切應(yīng)力，進(jìn)行了計(jì)算模擬。將壓力導(dǎo)管插入Ini或Outi底部的止血閥，測(cè)量hChaMP入口和出口的壓力分布。在計(jì)算模型中，將測(cè)量到的壓力剖面的最大值、最小值和平均值作為hChaMP流動(dòng)的輸入。SimVascular svFSI求解器是一款專門用于心血管模擬的開源軟件[28]，用于求解hChaMP的內(nèi)部流動(dòng)曲線。該軟件之前已經(jīng)在體外模型中進(jìn)行了驗(yàn)證，并證明了其在描述流動(dòng)動(dòng)力學(xué)方面的有效性[30]。使用該軟件和hChaMP的3D模型，流體流動(dòng)曲線與體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相匹配(圖2(b)、S4和視頻S2)，證實(shí)了該模型復(fù)制系統(tǒng)的能力。這允許計(jì)算在hChaMP內(nèi)壁上產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，這是干細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。
發(fā)現(xiàn)hChaMP內(nèi)的壓力相當(dāng)均勻，在單個(gè)泵循環(huán)中的變化與實(shí)驗(yàn)值相匹配，平均約為4.5-5.3mmHg，最大值為25.5 mmHg(圖2(c))。壓力在其最小值為負(fù)，反映了在泵的脈動(dòng)循環(huán)中所看到的情況。在灌注數(shù)天后，這種壓力的變化似乎沒有引起hChaMP完整性的問題。壁面剪切應(yīng)力變化較小，平均值約為1.0 dyn cm-2，在大部分hChaMP腔室中最大值為2.7 dyn cm-2，盡管在Outi附近隨著流體流出腔室急劇增加，達(dá)到15.0 dyn cm-2(圖2(c))。
由于外流存在復(fù)雜的幾何形狀，采用AnsysFluent求解外流廓線。Fluent是開源軟件SimVascular的商業(yè)替代品，已被廣泛用于心血管系統(tǒng)的流體流動(dòng)模式演示，包括體外模型[31]。求解了外流動(dòng)廓形，實(shí)現(xiàn)了hChaMP外壁面剪應(yīng)力的計(jì)算。外部的壓力和壁面剪切應(yīng)力要低得多，這可能是由于生物反應(yīng)器的大隔間尺寸和從Outi到Ine的壓力下降，導(dǎo)致hChaMP周圍的流量較低(圖2(d) - (f))。
有趣的是，外部的壓力取決于所分析的位置。流體首先與hChaMP接觸的下側(cè)最大壓力高于上側(cè);然而，兩者的差別相當(dāng)小，底部的最大壓力為1.13 × 10-4 mmHg，上部的最大壓力為1.05× 10-4 mmHg。與內(nèi)部流動(dòng)的壓力相似，hChaMP外部的最小壓力略為負(fù)，但在10 - 6 mmHg的量級(jí)上。墻體剪應(yīng)力也遠(yuǎn)低于內(nèi)部，范圍在10-7 -10-5 dyn cm?2之間(圖2(f))�？傮w而言，內(nèi)壁剪切應(yīng)力與干細(xì)胞擴(kuò)增的普通生物反應(yīng)器的剪切應(yīng)力范圍相似，而外部剪切應(yīng)力遠(yuǎn)低于其值，據(jù)報(bào)道約為0.7 - 2.5 dyn cm-2[32-34]。此外，發(fā)現(xiàn)水凝膠中嵌入的干細(xì)胞能夠承受大于30 dyn cm-2的應(yīng)力[22]，這表明我們?cè)O(shè)置的剪切應(yīng)力近似于hiPSC擴(kuò)增是合理的。
3.3. 灌注對(duì)hiPSCs生長(zhǎng)和分布的影響為了確定流體流動(dòng)對(duì)hiPSC增殖和分布的影響，在打印后1 d將hChaMPs插入生物反應(yīng)器中進(jìn)行灌注，使細(xì)胞有時(shí)間附著在結(jié)構(gòu)上(圖3(a))。隨后的每一天，錐形管作為介質(zhì)儲(chǔ)存庫(kù)替換為新鮮介質(zhì)。油管中的介質(zhì)，大約相當(dāng)于系統(tǒng)中總體積的一半，沒有被排干，以防止污染或氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。因此，每天使用mTeSR Plus更換50%的培養(yǎng)基。隨著組織工程中的生物制造技術(shù)變得越來越復(fù)雜，污染風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。然而，干細(xì)胞一般避免使用抗生素，即使是短期治療也是如此[35]。在這里，青霉素鏈霉素在灌注的第一天加入，并在隨后的培養(yǎng)基更換中逐漸稀釋。在這種情況下，短期暴露于青霉素-鏈霉素對(duì)三維培養(yǎng)中單一化hiPSCs的增殖和效力沒有影響（圖S6）。
圖3所示。灌注可改善hiPSC菌落的覆蓋和分布。(a) hChaMP增殖時(shí)間線，打印后第1天開始間歇灌注。(b) hChaMP橫 截面，用DAPI染色(白色)顯示培養(yǎng)7 d后，灌注或不灌注時(shí)整個(gè)hChaMP的細(xì)胞密度。(c)與靜態(tài)對(duì)照相比，灌注樣品中 hChaMP中的菌落密度增加了一倍。(d)間歇灌注不影響壁厚。(e)在hChaMP細(xì)胞壁上劃線，在ImageJ中進(jìn)行處理，確定 菌落在細(xì)胞壁上的分布。灌注后的hChaMPs與靜態(tài)hChaMPs相比，壁中部的菌落明顯增加。在組織壁各區(qū)域進(jìn)行靜態(tài)和灌注hChaMPs的比較。n = 3 hChaMPs。統(tǒng)計(jì)上不顯著;#p < 0.1，*p < 0.05，**p < 0.01)。
圖4。hiPSCs在灌注后仍能保持多能性和增生性。(a)、(b)灌注后的hChaMPs細(xì)胞中，OCT3/4 (a)和KI67 (b)的表達(dá)仍 然很高，與靜態(tài)對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)。n = 3個(gè)hChaMP，每個(gè)hChaMP >30個(gè)菌落。(c) RT-qPCR證實(shí)，與陰性(hiPSC)和陽性對(duì)照(hiPSC衍生的中胚層、內(nèi)胚層或外胚層)相比，多能性標(biāo)記物OCT4、NANOG和SOX2的高表達(dá)和胚層標(biāo)記物的低表達(dá)相對(duì)于GAPDH的表達(dá)。(d) PAX6蛋白在靜態(tài)和灌注hChaMPs中均未表達(dá)，但在胚層陽性對(duì)照中表達(dá)較低。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(分化第12天)作為參考，高水平的熒光信號(hào)對(duì)應(yīng)于PAX6的高表達(dá)。不重要的;*p < 0.05,**p < 0.01,***p?0.001,****p < 0.0001)。
hChaMPs流式培養(yǎng)6天，打印后總培養(yǎng)時(shí)間為7天，然后固定并冷凍切片分析。DAPI染色(圖3(b))用于確定活細(xì)胞菌落的大小和位置。在之前的工作中(圖S7)，我們發(fā)現(xiàn)不屬于菌落一部分的細(xì)胞是不可存活的，因?yàn)樗鼈兛赡茉谥圃焖璧膯位^程中死亡，并且仍然被包裹在工程組織中�；谶@些標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)灌注結(jié)構(gòu)的hiPSC菌落密度相對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)基中的對(duì)照組增加了1.9倍(圖3(c))。對(duì)切片組織進(jìn)行檢查，以驗(yàn)證流動(dòng)對(duì)hChaMP完整性沒有影響。靜態(tài)和灌注的hChaMPs保持一致的壁厚，約為1.2-1.4 mm(圖3(d))。此外，與靜態(tài)培養(yǎng)的hChaMPs相比，灌注hChaMPs改善了hiPSC菌落在細(xì)胞壁內(nèi)的分布(圖3(e))。灌注的hChaMPs中，大多數(shù)hipsc位于組織壁的中部，在組織壁的不同區(qū)域間菌落數(shù)量變化較小。另一方面，靜態(tài)對(duì)照的菌落位于hChaMP外側(cè)附近，在整個(gè)組織中的分布較少。有趣的是，灌注和靜態(tài)hChaMP在hChaMP最外層的菌落百分比相對(duì)于下一個(gè)內(nèi)部部分都要低。這可能是由于在支撐槽移除和介質(zhì)改變或灌注過程中細(xì)胞丟失所致。3.4. 灌注對(duì)hiPSC多能性的影響為了測(cè)試來自流體流動(dòng)的剪切應(yīng)力是否會(huì)導(dǎo)致hiPSCs的不良分化，對(duì)hChaMPs的冷凍切片進(jìn)行OCT3/4 IF染色(圖4(a))。集落的定性和定量分析表明，幾乎所有細(xì)胞都保持多能性，多能性與靜態(tài)對(duì)照相當(dāng)。此外，細(xì)胞高度增殖，KI67在整個(gè)菌落中呈陽性表達(dá)(圖4(b))。這表明hipsc在間歇灌注后仍保持其多能性和自我更新特性。接下來，使用RT-qPCR來量化多能性標(biāo)記，以及來自每個(gè)胚層的標(biāo)記，以在轉(zhuǎn)錄物水平上確認(rèn)我們的結(jié)果(圖4(c))。與2D培養(yǎng)的hiPSC對(duì)照相比，在靜態(tài)和灌注狀態(tài)下，OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)均保持較高水平�？偟膩碚f，除了一個(gè)例外，沒有檢測(cè)到胚層標(biāo)記物，或者發(fā)現(xiàn)相對(duì)
于hiPSCs或靜態(tài)hChaMPs的水平不顯著。外胚層標(biāo)志物PAX6在灌注hChaMP細(xì)胞中的表達(dá)高于2DhiPSCs (p=0.044)。然而，IF染色顯示PAX6在hChaMPs中沒有蛋白水平的表達(dá)(圖4(d))。
4. 結(jié)論在這里，我們展示了灌注hiPSCladen生物打印組織的能力，目的是增加工程組織的活細(xì)胞厚度。僅培養(yǎng)7天后，灌注就能顯著提高菌落密度，這是我們通常hChaMP增殖周期的一半。先前的灌注生物反應(yīng)器研究[36-40]發(fā)現(xiàn)，使用原代細(xì)胞類型可以提高組織內(nèi)的生存能力，而我們能夠使用對(duì)環(huán)境高度敏感的多能干細(xì)胞復(fù)制結(jié)果。此外，這些先前的研究通常是直接通過支架的孔隙向組織間質(zhì)灌注。在這里，我們展示了在組織周圍而不是直接通過組織的大體積流體流動(dòng)中獲得類似結(jié)果的能力。因此，本文所描述的與最佳生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)、通過精致水凝膠腔灌注以及hipsc的流動(dòng)考慮相關(guān)的概念將為潛在的任何組織類型的研究鋪平道路。在這種結(jié)構(gòu)分化后，可以產(chǎn)生較厚的組織，并伴隨組織功能的增加。
生物反應(yīng)器的開發(fā)是一個(gè)反復(fù)的過程，成功增殖的最重要參數(shù)是對(duì)軟水凝膠的精細(xì)處理和連接處的防泄漏，以確保通過hChaMP內(nèi)部進(jìn)行灌注。早期嘗試以垂直、直立的姿勢(shì)灌注hChaMP，成功地提高了細(xì)胞在內(nèi)部的活力。然而，難以設(shè)置hChaMP進(jìn)行灌注，并且需要一個(gè)小的隔間尺寸來保持hChaMP，最大限度地減少了hChaMP周圍的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體積，使得這些生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)不切實(shí)際。因此，目前的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)將hChaMP放置在仰臥位置，為養(yǎng)分交換提供了簡(jiǎn)單的設(shè)置和足夠的培養(yǎng)基體積。精細(xì)的操作仍然是灌注成功的關(guān)鍵。在hChaMP打印分辨率較差的情況下，管子插入變得更加困難，需要更嚴(yán)格的處理，導(dǎo)致培養(yǎng)第7天菌落形成急劇減少。此外，壓差在確保通過hChaMP內(nèi)部灌注方面發(fā)揮了重要作用。設(shè)計(jì)初期的一個(gè)常見問題是hChaMP油管連接處的泄漏，盡管添加了GelMA來形成密封。我們發(fā)現(xiàn)，在灌注前，必須在Outi處連接充滿DPBS的油管，以消除表面張力，這種張力會(huì)產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP內(nèi)部的灌注，導(dǎo)致連接處泄漏。再加上Outi相對(duì)于進(jìn)油管尺寸的增加，從本質(zhì)上解決了這個(gè)問題，促進(jìn)了流體通過hChaMP內(nèi)部的流動(dòng)。翻譯生物打印方法的一個(gè)很大的限制是需要大量的細(xì)胞達(dá)到生理密度，當(dāng)工程組織的大小增加到生理尺度時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。允許細(xì)胞在原位增殖減少了對(duì)大量孔板和相應(yīng)的單層擴(kuò)增介質(zhì)體積的需求。在這里，只需要一個(gè)6孔板(1000萬個(gè)hiPSCs)就可以產(chǎn)生厘米級(jí)的hChaMP。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間、打印時(shí)的細(xì)胞密度，或調(diào)整ROCK抑制劑和/或類似的生化化合物處理，可以進(jìn)一步增加分化前的hiPSC密度。增加培養(yǎng)時(shí)間可能會(huì)允許進(jìn)一步的細(xì)胞生長(zhǎng)，但不適合擴(kuò)大規(guī)模和組織應(yīng)用。這也可能進(jìn)一步影響基因表達(dá)。在培養(yǎng)的第7天，多能性和胚層標(biāo)記物在RNA水平上幾乎沒有變化，但灌注的hChaMPs中外胚層標(biāo)記物PAX6略有增加。在蛋白水平上，PAX6未在hChaMPs中表達(dá)。這一結(jié)果與暴露于0.003 - 5 dyn cm - 2剪切應(yīng)力下的小鼠PSCs的研究一致，其中神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)與靜態(tài)培養(yǎng)相當(dāng)[41,42]。與2D培養(yǎng)的hiPSCs相比，灌注的hChaMPs中NANOG RNA表達(dá)也有輕微但不顯著的增加。有趣的是，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于流動(dòng)的小鼠iPSCs中，NANOG和OCT4的表達(dá)也有類似的增加，這可能是由于涉及E-cadherin和/或β-catenin的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。此外，在人類多能干細(xì)胞中，NANOG被認(rèn)為可以抑制外胚層的形成[44]，并通過調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞周期的s期來增加細(xì)胞增殖[45]，這表明NANOG可能在灌注的hChaMPs中發(fā)揮有益作用。因此，需要進(jìn)一步的研究來確定長(zhǎng)時(shí)間灌注對(duì)hiPSCs的影響。生物墨水中的細(xì)胞密度可能會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化以增加菌落數(shù)量，但正如所討論的那樣，這受到用于打印的噴嘴尺寸的限制。另外，用10µM ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾治療多日可提高干細(xì)胞增殖率，s期細(xì)胞比例增加[46]。同樣，類黃酮3,2 ' -二羥黃酮(3,2 ' DHF)已被證明可以增加hiPSCs的增殖、s期細(xì)胞的百分比和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的表達(dá)[47]，這可能在細(xì)胞增殖的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用[48]。與單獨(dú)使用任何一種分子相比，3,2 ' -DHF和Y-27632聯(lián)合處理hiPSCs進(jìn)一步改善了增殖[47]，這表明有希望的方法可以與灌注結(jié)合進(jìn)一步改善細(xì)胞密度和組織厚度。在hChaMP中獲得所需的hiPSC密度后，下一步將是分化。先前的研究表明，在剪切作用下，有可能分化為中胚層[49-52]、內(nèi)胚層[53,54]和外胚層[51,55]。此外，考慮到剪切應(yīng)力在胎兒發(fā)育中的作用[56-59]，仿生血流可能有利于分化組織的功能。然而，在某些分化情況下，高水平的剪切應(yīng)力是有害的。例如，Ting等人發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞分化過程中，在搖椅上持續(xù)攪拌導(dǎo)致心肌細(xì)胞非常少;然而，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，間歇性攪拌可使分化效率提高約38%[49]。同樣，在微載體的肝臟分化中，在分化的早期階段，超過30 rpm的攪拌會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫離微載體[54]。因此，生物反應(yīng)器中的分化參數(shù)需要針對(duì)所需的組織類型進(jìn)行優(yōu)化，以平衡營(yíng)養(yǎng)輸送/廢物清除和維持細(xì)胞健康。作為誘導(dǎo)多系分化進(jìn)展的方法，原位hiPSC增殖的效用可以進(jìn)一步增強(qiáng)[60-65]。這種方法，從不同的支架材料特性到改變細(xì)胞因子或培養(yǎng)基成分以及基因工程hiPSCs，可以很容易地轉(zhuǎn)化為生物打印和生物反應(yīng)器設(shè)置，以獲得大量不同類型的細(xì)胞。分化為多種組織類型，可以研究發(fā)育過程中相關(guān)組織的形成，疾病進(jìn)展中不同組織之間的串?dāng)_，或各種治療方法和劑量對(duì)各種器官的潛在影響。例如，起搏器和心室心肌細(xì)胞的空間分化將極大地增強(qiáng)藥物篩選研究，提供對(duì)給定治療的心律和泵功能的見解。纖維母細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的摻入也可以進(jìn)一步增強(qiáng)仿生功能。
同樣，許多組織工程研究現(xiàn)在都集中在結(jié)合血管的方法上，以增加營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和可能的組織厚度。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)中納入內(nèi)皮細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞類型可能會(huì)導(dǎo)致不必要的旁分泌信號(hào)，從而影響打印組織中干細(xì)胞的多能性或分化效率[66]。在分化為所需的細(xì)胞類型后，內(nèi)皮細(xì)胞可以被納入像我們這樣的模型中，其中灌注可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)皮重要的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[67,68]，并可能誘導(dǎo)血管生成[69]。血管的存在將允許營(yíng)養(yǎng)輸送的增加，從而進(jìn)一步開發(fā)工程組織的效用。
生物3D打印領(lǐng)域的最新發(fā)展極大地?cái)U(kuò)展了創(chuàng)造復(fù)雜的、與生理相關(guān)的體外組織的潛力。當(dāng)這些組織由人類來源的細(xì)胞形成時(shí)，所產(chǎn)生的模型可以提供對(duì)疾病機(jī)制、進(jìn)展和治療的增強(qiáng)研究，作為動(dòng)物模型的補(bǔ)充。在這里，我們利用介質(zhì)灌注和3d生物打印室結(jié)構(gòu)中hipsc的高增殖能力，實(shí)現(xiàn)了生成厚組織模型的目標(biāo)�？偟膩碚f，我們預(yù)計(jì)，隨著該領(lǐng)域在創(chuàng)造更復(fù)雜組織方面的發(fā)展，特別是與正在開發(fā)的工程策略相結(jié)合，這種在這種模型中擴(kuò)展hipsc的能力將是重要的。在該模型中看到的連續(xù)的hipsc集落的形成將允許各種組織類型的原位分化，以便生成具有更高功能和一致性的組織，從而可靠地進(jìn)行體外建模。
數(shù)據(jù)可用性聲明支持本研究結(jié)果的所有數(shù)據(jù)都包含在文章中(以及任何補(bǔ)充文件)。
致謝我們感謝Jeffrey Ai幫助重新設(shè)計(jì)用于灌注的hChaMP結(jié)構(gòu)，Aimee Renaud生成外胚層陽性對(duì)照，Victor Garcia獲得hChaMP、生物反應(yīng)器和裝置的圖像，以及明尼蘇達(dá)大學(xué)實(shí)驗(yàn)外科服務(wù)部門幫助測(cè)量破裂壓力。我們感謝我們的資金來源，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院T32GM008347 (ERK)，R01HL137204 (ERK, WL和BMO)和NIBIB/NIH工程復(fù)雜組織中心P41 EB023833，以及美國(guó)心臟協(xié)會(huì)905669 (ERK)。
參考文獻(xiàn)
[1]Gudapati H, Dey M and Ozbolat I 2016 A comprehensivereview on droplet-based bioprinting: past, present andfuture Biomaterials 102 20–42
[2] Skylar-Scott M A, Uzel S G M, Nam L L, Ahrens J H,Truby R L, Damaraju S and Lewis J A 2019Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellulardensity and embedded vascular channels Sci. Adv. 5 9
[3]Murata D, Arai K and Nakayama K 2020 Scaffold-freebio-3D printing using spheroids as ‘bio-inks’ for tissue(re-)construction and drug response tests Adv. HealthcareMater. 9 1901831
[4] Daly A C, Davidson M D and Burdick J A 2021 3Dbioprinting of high cell-density heterogeneous tissue modelsthrough spheroid fusion within self-healing Nat. Commun.12 1–13
[5] Kupfer M E et al 2020 In situ expansion, differentiation andelectromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3Dbioprinted, chambered organoid Circ. Res. 127 207–24
[6] Ouyang L, Yao R, Mao S, Chen X, Na J and Sun W 2015Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cellsdirects highly uniform embryoid body formationBiofabrication 7 4
[7] Faulkner-Jones A, Fyfe C, Cornelissen D-J, Gardner J, King J,Courtney A and Shu W 2015 Bioprinting of humanpluripotent stem cells and their directed differentiation intohepatocyte-like cells for the generation of mini-livers in 3DBiofabrication 7 4
[8] Ouyang L, Yao R, Zhao Y and Sun W 2016 Effect of bioinkproperties on printability and cell viability for 3Dbioplotting of embryonic stem cells Biofabrication 8 3
[9] Gu Q, Tomaskovic-Crook E, Wallace G G and Crook J M2017 3D bioprinting human induced pluripotent stem cellconstructs for in situ cell proliferation and successivemultilineage differentiation Adv. Healthcare Mater. 6 17
[10] Li Y, Jiang X, Li L, Chen Z-N, Gao G, Yao R and Sun W 20183D printing human induced pluripotent stem cells withnovel hydroxypropyl chitin bioink: scalable expansion anduniform aggregation Biofabrication 10 4
[11] Hamid O A, Eltaher H M, Sottile V and Yang J 2021 3Dbioprinting of a stem cell-laden, multi-material tubularcomposite: an approach for spinal cord repair Mater. Sci.Eng. C 120 111707
[12] Kerscher P, Turnbull I C, Hodge A J, Kim J, Seliktar D,Easley C J, Costa K D and Lipke E A 2016 Direct hydrogelencapsulation of pluripotent stem cells enables ontomimeticdifferentiation and growth of engineered human hearttissues Biomaterials 83 383–95
[13] Gilmozzi V et al 2021 Generation of hiPSC-derivedfunctional dopaminergic neurons in alginate-based 3Dculture Front. Cell Dev. Biol. 9 708389
[14] Gao L et al 2017 Myocardial tissue engineering with cellsderived from human-induced pluripotent stem cells and anative-like, high-resolution, 3-dimensionally printedscaffold Circ. Res. 120 1318–25
[15] Radisic M, Malda J, Epping E, Geng W, Langer R andVunjak-Novakovic G 2006 Oxygen gradients correlate withcell density and cell viability in engineered cardiac tissueBiotechnol. Bioeng. 93 332–43
[16] Ahmed S, Chauhan V M, Ghaemmaghami A M andAylott J W 2018 New generation of bioreactors that advanceextracellular matrix modelling and tissue engineeringBiotechnol. Lett. 41 1–25
[17] Zhang J, Wehrle E, Rubert M and Müller R 2021 3Dbioprinting of human tissues: biofabrication, bioinks, andbioreactors Int. J. Mol. Sci. 22 3971
[18] Adamo L et al 2009 Biomechanical forces promoteembryonic haematopoiesis Nature 459 1131–5
[19] Yamamoto K, Sokabe T, Watabe T, Miyazono K,Yamashita J K, Obi S, Ohura N, Matsushita A, Kamiya A andAndo J 2005 Fluid shear stress induces differentiation ofFlk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelialcells in vitro Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 288 H1915–24
[20] Ahsan T and Nerem R M 2010 Fluid shear stress promotesan endothelial-like phenotype during the earlydifferentiation of embryonic stem cells Tissue Eng. A 16 3547
[21] Greuel S, Freyer N, Hanci G, Böhme M, Miki T, Werner J,Schubert F, Sittinger M, Zeilinger K and Mandenius C-F2019 Online measurement of oxygen enables continuousnoninvasive evaluation of human-induced pluripotent stemcell (hiPSC) culture in a perfused 3D hollow-fiber bioreactorJ. Tissue Eng. Regen. Med. 13 1203–16
[22] Fattahi P et al 2021 Core–shell hydrogel microcapsulesenable formation of human pluripotent stem cell spheroidsand their cultivation in a stirred bioreactor Sci. Rep.11 1–13
[23] Isidro I A et al 2021 Online monitoring of hiPSC expansionand hepatic differentiation in 3D culture by dielectricspectroscopy Biotechnol. Bioeng. 118 3610–7
[24] Borys B S et al 2021 Overcoming bioprocess bottlenecks inthe large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates invertical-wheel stirred suspension bioreactors Stem Cell Res.Ther. 12 1–19
[25] Nogueira D E S, Rodrigues C A V, Carvalho M S,Miranda C C, Hashimura Y, Jung S, Lee B and Cabral J M S2019 Strategies for the expansion of human inducedpluripotent stem cells as aggregates in single-useVertical-WheelTM bioreactors J. Biol. Eng. 13 74
[26] Zhu W, Zhao M, Mattapally S, Chen S and Zhang J 2018CCND2 overexpression enhances the regenerative potency ofhuman induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes: remuscularization of injured ventricle Circ.Res. 122 88–96
[27] Lee A, Hudson A R, Shiwarski D J, Tashman J W, Hinton T J,Yerneni S, Bliley J M, Campbell P G and Feinberg A W 20193D bioprinting of collagen to rebuild components of thehuman heart Science 365 482–7
[28] Figueroa C A, Vignon-Clementel I E, Jansen K E,Hughes T J R and Taylor C A 2006 A coupled momentummethod for modeling blood flow in three-dimensionaldeformable arteries Comput. Methods Appl. Mech. Eng.195 5685–706
[29] Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S andMadden T L 2012 Primer-BLAST: a tool to designtarget-specific primers for polymerase chain reaction BMCBioinform. 13 134
[30] Kung E O, Les A S, Figueroa C A, Medina F, Arcaute K,Wicker R B, McConnell M V and Taylor C A 2011 In vitrovalidation of finite element analysis of blood flow indeformable models Ann. Biomed. Eng. 39 1947–60
[31] Bonfanti M, Franzetti G, Homer-Vanniasinkam S,Díaz-Zuccarini V and Balabani S 2020 A combined in vivo, invitro, in silico approach for patient-specific haemodynamicstudies of aortic dissection Ann. Biomed. Eng. 48 2950–64
[32] Sargent C Y, Berguig G Y, Kinney M A, Hiatt L A,Carpenedo R L, Berson R E and McDevitt T C 2010Hydrodynamic modulation of embryonic stem celldifferentiation by rotary orbital suspension cultureBiotechnol. Bioeng. 105 611–26
[33] Wang Y, Chou B K, Dowey S, He C, Gerecht S and Cheng L2013 Scalable expansion of human induced pluripotentstem cells in the defined xeno-free E8 medium underadherent and suspension culture conditions Stem Cell Res.11 1103–16
[34] Ismadi M Z, Gupta P, Fouras A, Verma P, Jadhav S, Bellare Jand Hourigan K 2014 Flow characterization of a spinnerflask for induced pluripotent stem cell culture applicationPLoS One 9 e106493
[35] Farzaneh M 2021 Concise review; effects of antibiotics andantimycotics on the biological properties of humanpluripotent and multipotent stem cells Curr. Stem Cell Res.Ther. 16 400–5
[36] Carrier R L, Rupnick M, Langer R, Schoen F J, Freed L E andVunjak-Novakovic G 2002 Perfusion improves tissuearchitecture of engineered cardiac muscle Tissue Eng.8 175–88
[37] Radisic M, Yang L, Boublik J, Cohen R J, Langer R, Freed L Eand Vunjak-Novakovic G 2004 Medium perfusion enablesengineering of compact and contractile cardiac tissue Am. J.Physiol.—Heart Circ. Physiol. 286 507–16
[38] Dahlin R L, Meretoja V V, Ni M, Kasper F K and Mikos A G2012 Design of a high-throughput flow perfusion bioreactorsystem for tissue engineering Tissue Eng. C 18 817–20
[39] Gabetti S et al 2022 An automated 3D-printed perfusionbioreactor combinable with pulsed electromagnetic fieldstimulators for bone tissue investigations Sci. Rep. 12 13859
[40] Yamada S, Yassin M A, Schwarz T, Mustafa K andHansmann J 2022 Optimization and validation of acustom-designed perfusion bioreactor for bone tissueengineering: flow assessment and optimal cultureenvironmental conditions Front. Bioeng. Biotechnol.10 811942
[41] Nsiah B A, Ahsan T, Griffiths S, Cooke M, Nerem R M andMcDevitt T C 2014 Fluid shear stress pre-conditioningpromotes endothelial morphogenesis of embryonic stemcells within embryoid bodies Tissue Eng. A 20 954–65
[42] Blagovic K, Kim L Y and Voldman J 2011 Microfluidicperfusion for regulating diffusible signaling in stem cellsPLoS One 6 8
[43] Nath S C, Day B, Harper L, Yee J, Hsu C Y-M, Larijani L,Rohani L, Duan N, Kallos M S and Rancourt D E 2021 Fluidshear stress promotes embryonic stem cell pluripotency viainterplay between β-catenin and vinculin in bioreactorculture Stem Cells 39 1166–77
[44] Wang Z, Oron E, Nelson B, Razis S and Ivanova N 2012Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, andSOX2 in human embryonic stem cells Cell Stem Cell10 440–54
[45] Zhang X et al 2009 A role for NANOG in G1 to S transitionin human embryonic stem cells through direct binding ofCDK6 and CDC25A J. Cell Biol. 184 67
[46] Watanabe K et al 2007 A ROCK inhibitor permits survival ofdissociated human embryonic stem cells Nat. Biotechnol.25 681–6
[47] Kim K et al 2020 3,2′ -Dihydroxyflavone improves theproliferation and survival of human pluripotent stem cellsand their differentiation into hematopoietic progenitor cellsJ. Clin. Med. 9 3
[48] Pallardó F V, Markovic J, García J L and Vi˜na J 2009 Role ofnuclear glutathione as a key regulator of cell proliferationMol. Aspects Med. 30 77–85
[49] Ting S, Chen A, Reuveny S and Oh S 2014 An intermittentrocking platform for integrated expansion anddifferentiation of human pluripotent stem cells tocardiomyocytes in suspended microcarrier cultures Stem CellRes. 13 202–13
[50] Correia C et al 2014 Combining hypoxia and bioreactorhydrodynamics boosts induced pluripotent stem celldifferentiation towards cardiomyocytes Stem Cell Rev. Rep.10 786–801
[51] Badenes S M, Fernandes T G, Cordeiro C S M, Boucher S,Kuninger D, Vemuri M C, Diogo M M and Cabral J M S2016 Defined essential 8TM medium and vitronectinefficiently support scalable xeno-free expansion of humaninduced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culturesystems PLoS One 11 e0151264
[52] Ackermann M et al 2018 Bioreactor-based mass productionof human iPSC-derived macrophages enablesimmunotherapies against bacterial airway infections Nat.Commun. 9 1–13
[53] Lock L T and Tzanakakis E S 2009 Expansion anddifferentiation of human embryonic stem cells to endodermprogeny in a microcarrier stirred-suspension culture TissueEng. A 15 2051–63
[54] Park Y, Chen Y, Ordovas L and Verfaillie C M 2014 Hepaticdifferentiation of human embryonic stem cells onmicrocarriers J. Biotechnol. 174 39–48
[55] Qiu L, Lim Y M, Chen A K, Reuveny S, Oh S K W, Tan E Kand Zeng L 2016 Microcarrier-expanded neural progenitorcells can survive, differentiate, and innervate host neuronsbetter when transplanted as aggregates Cell Transplant.25 1343–57
[56] Hove J R, Köster R W, Forouhar A S, Acevedo-Bolton G,Fraser S E and Gharib M 2003 Intracardiac fluid forces arean essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesisNature 421 172–7
[57] Courchaine K, Rykiel G and Rugonyi S 2018 Influence ofblood flow on cardiac development Prog. Biophys. Mol. Biol.137 95
[58] Conrad L et al 2021 The biomechanical basis of biasedepithelial tube elongation in lung and kidney developmentDevelopment 148 9
[59] Lorenz L et al 2018 Mechanosensing by β1 integrin inducesangiocrine signals for liver growth and survival Nature562 128–32
[60] Ng W H et al 2022 Recapitulating human cardio-pulmonaryco-development using simultaneous multilineagedifferentiation of pluripotent stem cells eLife 11 e67872
[61] Skylar-Scott M A, Huang J Y, Lu A, Ng A H M, Duenki T,Liu S, Nam L L, Damaraju S, Church G M and Lewis J A2022 Orthogonally induced differentiation of stem cells forthe programmatic patterning of vascularized organoids andbioprinted tissues Nat. Biomed. Eng. 6 449–62
[62] Giacomelli E, Bellin M, Sala L, van Meer B J, Tertoolen L G J,Orlova V V and Mummery C L 2017 Three-dimensionalcardiac microtissues composed of cardiomyocytes andendothelial cells co-differentiated from human pluripotentstem cells Development 144 1008–17
[63] Wu F, Wu D, Ren Y, Huang Y, Feng B, Zhao N, Zhang T,Chen X, Chen S and Xu A 2019 Generation of hepatobiliaryorganoids from human induced pluripotent stem cells J.Hepatol. 70 1145–58
[64] Jin G, Floy M E, Simmons A D, Arthur M M and Palecek S P2021 Spatial stem cell fate engineering via facile morphogenlocalization Adv. Healthcare Mater. 10 2100995
[65] Kilian D, Cometta S, Bernhardt A, Taymour R, Golde J,Ahlfeld T, Emmermacher J, Gelinsky M and Lode A 2022Core-shell bioprinting as a strategy to apply differentiationfactors in a spatially defined manner inside osteochondraltissue substitutes Biofabrication 14 1
[66] Freyer N, Greuel S, Knöspel F, Strahl N, Amini L, Jacobs F,Monshouwer M and Zeilinger K 2017 Effects of co-culturemedia on hepatic differentiation of hiPSC with or withoutHUVEC co-culture Int. J. Mol. Sci. 18 1724
[67] Davies P F 2009 Hemodynamic shear stress and theendothelium in cardiovascular pathophysiology Nat. Clin.Pract. Cardiovasc. Med. 6 16–26
[68] Kinstlinger I S, Calderon G A, Royse M K, Means A K,Grigoryan B and Miller J S 2021 Perfusion andendothelialization of engineered tissues with patternedvascular networks Nat. Protocols 16 3089–113
[69] Galie P A, Nguyen D H T, Choi C K, Cohen D M, Janmey P Aand Chen C S 2014 Fluid shear stress threshold regulatesangiogenic sprouting Proc. Natl Acad. Sci. USA 111 7968–73
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