圖1.通過堿基編輯器對出生后小鼠心臟中的 Scn5a 基因組進行編輯


 

圖2.攜帶Scn5a T1307M致病性變異的LQT3小鼠模型的生成
 

同時還對小鼠模型離體心臟進行了光學標測，結果顯示，與 WT 小鼠相比，心室傳導無差異，但雜合子和純合子 T1307M 小鼠的心室動作電位時程 APD90顯著延長，APD30 / APD80比率增加（圖 S8）。當從心尖給予 8 Hz 刺激時，獲得了一致的結果。然后，我們通過全細胞膜片鉗檢測了離體心室心肌細胞的動作電位和鈉電流。與 WT 肌細胞相比，Scn5a T1307M心肌細胞的晚期鈉電流密度顯著增加，都體現(xiàn)了人類LQT3的疾病表型。以上結果說明模型構建成功。
 

圖S8. 自發(fā)節(jié)律下離體心臟的光學標測
 

2. ABE 對 Scn5a T1307M 的體內校正并減輕了LQT3表型
T1307M突變是由堿基C變成T形成的。ABE堿基編輯器能將T轉變成C，進而糾正堿基突變。實驗中采用反式剪接將ABE分成兩段后，利用AAV9送到小鼠體內。單次腹腔注射AAV9-ABE 病毒可以實現(xiàn)~40%的DNA糾正及~70%的mRNA糾正。而AAV9主要是感染心肌細胞，Scn5a主要在心肌細胞中表達，所以在Scn5a mRNA水平的糾正效率高。這些發(fā)現(xiàn)表明 ABE 可以有效糾正小鼠心臟中的 Scn5a T1307M 序列變異。ABE治療還減少了雜合子和純合小鼠中由卡巴膽堿給藥引起的心竇驟停，并消除了純合子 Scn5a T1307M 小鼠中卡巴膽堿誘導的 TdP 或 VT（圖3）。以上結果說明堿基編輯技術針對心肌細胞的基因編輯治療對于電生理功能表型是有效和安全的，可以有效的減輕 LQT3 表型。
 

圖3. 體內堿基編輯技術減輕了 LQT3 表型。
 

3.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值及脫靶效應檢測
為了探究多高的編輯效率可以治療 LQT3 表型，研究人員向新生2周齡的雜合小鼠腹腔注射AAV9-ABE病毒。10周后，觀察到 T1307M mRNA的修正率從 23.29% 到 95.72% 不等。將mRNA修正率與 QT間期以及竇性停搏次數(shù)關聯(lián)。結果顯示隨著修正率的增加，QT及QTc間期逐漸縮短，卡巴膽堿誘導的竇性停搏次數(shù)逐漸下降（圖4），即使較低的編輯效率，也能減輕長QT的表型。

當mRNA 的修正率超過60%時，可完全消除雜合小鼠的心律失常表型。同時，在純合T1307M小鼠中，堿基編輯還消除了致命性室性心動過速（圖4）。這些結果表明編輯效率達到一定的閾值時，可以完全消除心律失常表型。
 

圖4.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值
 

為了評價ABE心臟治療的安全性，研究人員對基因編輯后的心臟DNA進行全轉錄組測序，測序結果并未發(fā)現(xiàn)明顯的DNA或RNA脫靶（圖5）。堿基編輯也沒有引發(fā)額外的心率失常。這些結果表明 ABE 是一種安全的體內心臟編輯工具。
 

圖5.堿基編輯器的脫靶效應檢測


圖6.總體示意圖模型

總之，這些研究表明，體內 AAV9-ABEmax 編輯可以糾正變異的 Scn5a 等位基因，有效改善心律失常表型。為遺傳性心律失常的治療提供了有效的概念性證明。