免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)流程介紹
免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) (immunocytochemistry) 是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。它是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體 (或抗原) 對(duì)組織內(nèi)抗原 (或抗體) 的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)技術(shù)。
一、免疫組化技術(shù)的基本原理
應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究。
眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過(guò)氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)（常用顯色劑 DAB 顯示為棕黃色顆粒）。
通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。
二、幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理
1、免疫熒光方法
是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。
2、免疫酶標(biāo)方法
免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)�；驹硎窍纫悦笜�(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。
本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。
免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來(lái)越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬 PAP 法、ABC 法、SP 法等。
3、免疫膠體金技術(shù)
免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白) 等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
三、免疫組織化學(xué)染色方法
1、按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。
2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3、按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中 SP 法是最常用的方法。
四、免疫組化實(shí)驗(yàn)流程：
免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類。組織標(biāo)本中包括石蠟切片（標(biāo)本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無(wú)褶無(wú)刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的刀工，建議找專業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員或公司進(jìn)行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對(duì)著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細(xì)胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤(rùn)切片 30 min（RT 避光），降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新「滿血復(fù)活」。
小魚(yú)常用的是微波修復(fù)，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù) 2 次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來(lái)源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫(huà)圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過(guò)夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過(guò)夜后，需要將切片放置 37℃ 復(fù)溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）
6、孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過(guò)顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。
8、復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹(shù)膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
五、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
1、特異性強(qiáng)
免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
2、敏感性高
在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于 ABC 法或 SP 法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。
3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合
該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。
一、免疫組化技術(shù)的基本原理
應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位或定量研究。
眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過(guò)氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)（常用顯色劑 DAB 顯示為棕黃色顆粒）。
通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。
二、幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理
1、免疫熒光方法
是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。
2、免疫酶標(biāo)方法
免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)�；驹硎窍纫悦笜�(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。
本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。
免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來(lái)越方便。目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬 PAP 法、ABC 法、SP 法等。
3、免疫膠體金技術(shù)
免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白) 等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。
三、免疫組織化學(xué)染色方法
1、按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。
2、按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3、按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中 SP 法是最常用的方法。
四、免疫組化實(shí)驗(yàn)流程：
免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類。組織標(biāo)本中包括石蠟切片（標(biāo)本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無(wú)褶無(wú)刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的刀工，建議找專業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員或公司進(jìn)行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對(duì)著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細(xì)胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤(rùn)切片 30 min（RT 避光），降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新「滿血復(fù)活」。
小魚(yú)常用的是微波修復(fù)，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù) 2 次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來(lái)源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫(huà)圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過(guò)夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過(guò)夜后，需要將切片放置 37℃ 復(fù)溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）
6、孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過(guò)顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。
8、復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹(shù)膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
五、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
1、特異性強(qiáng)
免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
2、敏感性高
在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于 ABC 法或 SP 法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。
3、定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合
該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。
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