五種常見的細(xì)胞增殖檢測技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)流程分享
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)常用方法包括細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法、BrdU染色法、CCK-8法、克隆形成法，這些實(shí)驗(yàn)通常需借助顯微鏡和分光光度計(jì)完成。以上方法需頻繁拿出細(xì)胞，那么有什么新方法可以彌補(bǔ)這種不足呢？本文將介紹一種新的方法-使用活細(xì)胞成像系統(tǒng)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)時(shí)動態(tài)成像，監(jiān)測細(xì)胞的增殖情況。我們分析了新方法對比常用方法的優(yōu)勢，同時(shí)列舉了幾篇活細(xì)胞成像系統(tǒng)應(yīng)用在細(xì)胞增殖方向的發(fā)表在《Nature communications》、《Science translational medicine》、《Cell Reports》期刊的高分文章，該方法獲得了高校老師的認(rèn)可，且在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中被推廣使用，證實(shí)了新方法的可靠性。
細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。
細(xì)胞增殖能力是細(xì)胞活性的直接表現(xiàn)。
細(xì)胞增殖檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)、藥理和藥代動力學(xué)等研究領(lǐng)域。 常見的細(xì)胞增殖檢測方法有以下5種。
1.細(xì)胞計(jì)數(shù)法
細(xì)胞增殖表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增多，通過計(jì)數(shù)板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀得出細(xì)胞數(shù)目，繪制生長曲線。
操作方法：一般過程為接種細(xì)胞，分組培養(yǎng)7天，逐日檢測細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制成圖，即為細(xì)胞生長曲線。
不足：操作繁瑣，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，不適合數(shù)量較多或特定亞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.MTT法
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。
簡易流程：
2.1、接種細(xì)胞：制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種到多孔板中。
2.2、培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。
2.3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液。繼續(xù)孵育，加DMSO，使結(jié)晶物充分融解。
2.4、比色：在 490nm波長下檢測吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
不足：工作量大，且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑有毒性，對細(xì)胞造成損傷。
3. BrdU染色法
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復(fù)制細(xì)胞中新合成的DNA中（細(xì)胞周期S期）。通過檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。
簡易實(shí)驗(yàn)流程如下：
3.1、對細(xì)胞進(jìn)行接種，根據(jù)不同條件進(jìn)行藥物處理。
3.2、制備適量BrdU培養(yǎng)基，孵育。除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌。
3.3、加入多聚甲醛常溫固定，PBS沖洗。
3.4、加入含 Triton X-100的PBS，在冰上將細(xì)胞膜穿刺，加入預(yù)冷的PBS沖洗。
3.5、加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1：50)，陰性對照加PBS或血清。
3.6、按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡或活細(xì)胞成像系統(tǒng)下拍照。
不足：破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確性較低
4. CCK-8法
CCK-8試劑中含有WST–8，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
4.1、將處理過的細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，接種1000個細(xì)胞至96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 h、24h、48h和72h。
4.2、每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。
4.3、在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5h，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度。
不足：CCK-8價(jià)格較貴，且試劑顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，操作過程中容易多加或漏加。
5. 克隆形成法
細(xì)胞在體外增殖，形成集落，集落的大小和數(shù)量反應(yīng)該細(xì)胞獨(dú)立生存能力和增殖能力，從而反映細(xì)胞增殖的情況。
實(shí)驗(yàn)流程：
5.1、接種細(xì)胞于六孔板中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.2、培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胨幬锘蚱渌幚?/span>。
5.3、每隔一定時(shí)間更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，去除培養(yǎng)基，加入PBS洗一次。
5.4、加入多聚甲醛或者乙醇固定，去除培養(yǎng)基，加入結(jié)晶紫染色液，常溫染色。
5.5、加入PBS洗3次，將六孔板放入烘箱中烘干，對克隆細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和拍照。
不足：培養(yǎng)時(shí)間長，操作繁瑣，頻繁取出觀察，影響細(xì)胞生長環(huán)境。
綜上所述，傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖檢測方法，操作繁瑣，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，且個別試劑會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成影響。耗時(shí)、耗力、實(shí)驗(yàn)成功率不能保證，最終影響實(shí)驗(yàn)效率。
那么，有什么新工具可以彌補(bǔ)這些不足，助力細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)呢？持續(xù)關(guān)注奎克泰生物，下篇文章將繼續(xù)為您科普細(xì)胞增殖知識~
細(xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。
細(xì)胞增殖能力是細(xì)胞活性的直接表現(xiàn)。
1.細(xì)胞計(jì)數(shù)法
細(xì)胞增殖表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增多，通過計(jì)數(shù)板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀得出細(xì)胞數(shù)目，繪制生長曲線。
操作方法：一般過程為接種細(xì)胞，分組培養(yǎng)7天，逐日檢測細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制成圖，即為細(xì)胞生長曲線。
不足：操作繁瑣，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，不適合數(shù)量較多或特定亞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。
簡易流程：
2.1、接種細(xì)胞：制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種到多孔板中。
2.2、培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間)。
2.3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液。繼續(xù)孵育，加DMSO，使結(jié)晶物充分融解。
2.4、比色：在 490nm波長下檢測吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
不足：工作量大，且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑有毒性，對細(xì)胞造成損傷。
3. BrdU染色法
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復(fù)制細(xì)胞中新合成的DNA中（細(xì)胞周期S期）。通過檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。
簡易實(shí)驗(yàn)流程如下：
3.1、對細(xì)胞進(jìn)行接種，根據(jù)不同條件進(jìn)行藥物處理。
3.2、制備適量BrdU培養(yǎng)基，孵育。除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌。
3.3、加入多聚甲醛常溫固定，PBS沖洗。
3.4、加入含 Triton X-100的PBS，在冰上將細(xì)胞膜穿刺，加入預(yù)冷的PBS沖洗。
3.5、加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1：50)，陰性對照加PBS或血清。
3.6、按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡或活細(xì)胞成像系統(tǒng)下拍照。
不足：破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確性較低
4. CCK-8法
CCK-8試劑中含有WST–8，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。
4.1、將處理過的細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，接種1000個細(xì)胞至96孔板，每孔100 μL培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 h、24h、48h和72h。
4.2、每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。
4.3、在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5h，用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度。
不足：CCK-8價(jià)格較貴，且試劑顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，操作過程中容易多加或漏加。
5. 克隆形成法
細(xì)胞在體外增殖，形成集落，集落的大小和數(shù)量反應(yīng)該細(xì)胞獨(dú)立生存能力和增殖能力，從而反映細(xì)胞增殖的情況。
實(shí)驗(yàn)流程：
5.1、接種細(xì)胞于六孔板中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.2、培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤胨幬锘蚱渌幚?/span>。
5.3、每隔一定時(shí)間更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，去除培養(yǎng)基，加入PBS洗一次。
5.4、加入多聚甲醛或者乙醇固定，去除培養(yǎng)基，加入結(jié)晶紫染色液，常溫染色。
5.5、加入PBS洗3次，將六孔板放入烘箱中烘干，對克隆細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和拍照。
不足：培養(yǎng)時(shí)間長，操作繁瑣，頻繁取出觀察，影響細(xì)胞生長環(huán)境。
綜上所述，傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖檢測方法，操作繁瑣，需頻繁將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱，且個別試劑會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成影響。耗時(shí)、耗力、實(shí)驗(yàn)成功率不能保證，最終影響實(shí)驗(yàn)效率。
那么，有什么新工具可以彌補(bǔ)這些不足，助力細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)呢？持續(xù)關(guān)注奎克泰生物，下篇文章將繼續(xù)為您科普細(xì)胞增殖知識~
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