內(nèi)容摘要
自SARS-CoV-2大流行爆發(fā)以來(lái)，對(duì)純化的病毒成分和滅活病毒進(jìn)行了深入的結(jié)構(gòu)研究。然而，關(guān)于SARS-CoV-2感染如何在天然細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行的結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)證據(jù)很少，并且缺乏關(guān)于SARS-CoV-2復(fù)制周期的全面知識(shí)。為了將SARS-CoV-2誘導(dǎo)的細(xì)胞病變事件與冷凍水合細(xì)胞中的病毒復(fù)制過(guò)程相關(guān)聯(lián)，我們建立了一個(gè)獨(dú)特的多模式、多尺度冷凍相關(guān)平臺(tái)，以對(duì)Vero細(xì)胞中SARS-CoV-2感染進(jìn)行成像。該平臺(tái)將連續(xù)低溫FIB/SEM體積成像和軟X射線低溫層析成像與基于細(xì)胞薄片的低溫電子層析成像（CryoET）和亞同步圖平均相結(jié)合。在這里，我們報(bào)告了關(guān)鍵的SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)事件，例如病毒RNA轉(zhuǎn)運(yùn)入口、病毒組裝中間體、病毒出口途徑和天然病毒刺突結(jié)構(gòu)，在整個(gè)細(xì)胞體積的背景下，揭示了劇烈的細(xì)胞化學(xué)變化。這種綜合方法允許從整個(gè)細(xì)胞到單個(gè)分子全面觀察SARS-CoV-2感染。

自2019年12月以來(lái)，世界一直處于被稱為“本世紀(jì)最大的流行病”的中期。病原體是嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2），由此引發(fā)的疾病是2019年冠狀病毒病。冠狀病毒是具有陽(yáng)性非分段RNA基因組的小型包膜病毒。在RNA病毒中，冠狀病毒擁有最大的基因組之一，它們的復(fù)制是復(fù)雜的，包括移碼和復(fù)制酶跳躍，產(chǎn)生大量的RNA雙鏈體。冠狀病毒和大多數(shù)RNA病毒一樣，誘導(dǎo)一系列膜室的發(fā)育，這些膜室隔離并保護(hù)病毒成分，從而提高復(fù)制效率和先天免疫識(shí)別逃逸。

所有冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白都是由正義亞基因組RNA片段的翻譯產(chǎn)生的，正義亞基因RNA片段是由負(fù)義亞基因組RNAs片段產(chǎn)生的，而負(fù)義亞基因RNAs片段又是由病毒基因組轉(zhuǎn)錄時(shí)的復(fù)制酶跳躍產(chǎn)生的。其中，S蛋白構(gòu)成病毒刺突，負(fù)責(zé)細(xì)胞附著、進(jìn)入和融合。它采用兩種主要構(gòu)象：融合前，由亞基S1和S2的三聚體組成；融合后，僅由S2組成的非活性構(gòu)象。N蛋白負(fù)責(zé)包裹和保護(hù)基因組病毒RNA（vRNA），形成駐留在病毒顆粒內(nèi)部空間的核糖核蛋白復(fù)合物。E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，被認(rèn)為是離子通道。最后，M蛋白在SARS-CoV-2中含量最高，是一種跨膜蛋白，分布在病毒脂質(zhì)膜的內(nèi)表面。

在這項(xiàng)研究中，我們利用了一種獨(dú)特的相關(guān)多模態(tài)多尺度冷凍成像方法來(lái)研究在接近自然條件下Vero細(xì)胞中SARS-CoV-2的復(fù)制。該方法使SARS-CoV-2感染從整個(gè)細(xì)胞到單個(gè)病毒刺突分子的整體觀點(diǎn)成為可能，揭示了SARS-CoV-2組裝的途徑以及SARS-CoV-1感染的出口和細(xì)胞病變效應(yīng)。這些結(jié)果證實(shí)了之前通過(guò)對(duì)染色的塑料包埋樣品進(jìn)行薄片電子顯微鏡（EM）和連續(xù)聚焦離子束掃描電子顯微鏡（FIB/SEM）獲得的發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步擴(kuò)展了我們對(duì)SARS-CoV-2組裝和出口以及其在其他膜室中的存在的了解。它驗(yàn)證了連續(xù)低溫FIB/SEM和軟X射線斷層掃描作為研究與高分辨率低溫電子斷層掃描（cryoET）相關(guān)的全細(xì)胞形態(tài)的技術(shù)，具有冷凍水合條件和快速直接制備樣品的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞系和病毒
將非洲綠猴腎Vero Cc-81細(xì)胞（雌性）（ATCC，Ccl-81）保存在補(bǔ)充有5%胎牛血清、10單位/mL青霉素（Gibco）、10µg/mL鏈霉素（Gibco）和2mM L-谷氨酰胺的默克高糖培養(yǎng)基(D-MEM)中。細(xì)胞系未經(jīng)驗(yàn)證。SARS-CoV-2分離株Beta CoV/England/02/2020（EPI_ISL_407073）由Maria Zambon教授貯藏，并通過(guò)BEI資源、NIAID、NIH：SARS相關(guān)冠狀病毒2，分離株England/02/2020NR-52359獲得。本研究中使用的病毒原液已通過(guò)Vero Ccl-81細(xì)胞中的菌斑測(cè)定進(jìn)行滴定，并進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)通過(guò)擴(kuò)增傳代保留了核苷酸呋喃裂解位點(diǎn)（FCS）。

樣品制備
Vero Ccl-81細(xì)胞（ATCC）保持如上所述。將16000個(gè)細(xì)胞接種在六孔板孔中經(jīng)纖維連接蛋白處理的G300F1 R2/2金電鏡載網(wǎng)的碳膜側(cè)。使用SARS-CoV-2 England/02/2020的第3代進(jìn)行感染，MOI為0.5、0.1或0（陰性對(duì)照）。從Vero Ccl-81細(xì)胞（ATCC）中取出培養(yǎng)基，并用1%胎牛血清、10單位/mL青霉素（Gibco）、10µg/mL鏈霉素（Gibco）和2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）稀釋在0.5mL D-MEM高糖培養(yǎng)基（Merck）中的適量病毒替換。將細(xì)胞在室溫下孵育15分鐘，然后向每個(gè)孔中再加入1.5mL培養(yǎng)基。然后將平板在37°C下孵育24小時(shí)，然后丟棄上清液并用2 mL PBS洗滌細(xì)胞。然后通過(guò)在PBS中加入3mL 4%多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞1小時(shí)。固定后，將載網(wǎng)放置在徠卡GP2中，將1µl BSA（EMS）中的濃縮10nm金基準(zhǔn)點(diǎn)施加到電鏡載網(wǎng)的背面，并從背面進(jìn)行印跡，印跡后將載網(wǎng)浸入液態(tài)乙烷中冷凍。玻璃化載網(wǎng)儲(chǔ)存在液氮中，直到收集數(shù)據(jù)。

CryoET數(shù)據(jù)采集
傾斜系列采集是在FEI Titan Krios G2（Thermo Fisher Scientific）透射電鏡上進(jìn)行的，該電鏡可在300kV下操作，并配備了能量過(guò)濾器和post-GIF K3探測(cè)器。使用SerialEM 3.8版傾斜系列控制器記錄傾斜系列，完整細(xì)胞的像素大小為1.63、2.13和4.58Å，薄片的像素大小為2.13和7.58Å。零損耗成像用于具有20eV狹縫寬度的所有傾斜系列。散焦值范圍為−2至−7µm，但使用50µm散焦的7.58Å像素大小的薄片除外。插入100µm物鏡光闌。所有傾斜系列均采用分組劑量對(duì)稱方案；在+/-60度范圍內(nèi)以3度增量收集完整細(xì)胞，每組3個(gè)，總劑量為120–135 e/Å2；對(duì)于薄片，在+/-54度范圍內(nèi)以3度增量收集，在4.58Å時(shí)為每組3個(gè)，總劑量為120–135 e/Å2，在7.58 Å時(shí)為每組10個(gè)，總劑量為70–90 e/Å2。在每次傾斜時(shí)進(jìn)行自動(dòng)聚焦和跟蹤，并以10Å/s的目標(biāo)速率在傾斜反轉(zhuǎn)時(shí)進(jìn)行漂移測(cè)量。在每次傾斜時(shí)，在超分辨率模式下使用相關(guān)雙采樣記錄5個(gè)影片幀，并以lzw壓縮tif格式保存，無(wú)增益歸一化。影片隨后在運(yùn)動(dòng)校正期間進(jìn)行增益歸一化，并將傅里葉裁剪回物理像素大小。在每個(gè)傾斜系列之后，運(yùn)行腳本以獲取新的暗參考并重置散焦偏移�？偣彩占�了294個(gè)傾斜序列，其中56個(gè)傾斜序列來(lái)自未感染的對(duì)照細(xì)胞（20個(gè)來(lái)自細(xì)胞薄片，36個(gè)來(lái)自細(xì)胞外周），238個(gè)傾斜序列源自SARS-CoV-2感染的細(xì)胞（90個(gè)來(lái)自薄片，148個(gè)來(lái)自細(xì)胞外周）。
 

結(jié)論
SARS-CoV-2復(fù)制在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)深刻的細(xì)胞病變效應(yīng)。為了在接近生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞內(nèi)體系中SARS-CoV-2的復(fù)制進(jìn)行成像和研究，我們用SARS-CoV-2以0.1和0.5倍感染率（MOI）去感染在編碼的電鏡載網(wǎng)上生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞。在感染后24小時(shí)（hpi），將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并浸入液體乙烷中冷凍。如工作流程所示（補(bǔ)充圖1），首先在Titan Krios中對(duì)含有SARS-CoV-2感染細(xì)胞的電鏡載網(wǎng)進(jìn)行成像，以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外圍的大量病毒顆粒來(lái)識(shí)別感染細(xì)胞（MOI為0.1時(shí)為39.2%，MOI為0.5時(shí)為45.4%）。Vero細(xì)胞中SARS-CoV-2復(fù)制動(dòng)力學(xué)小于24小時(shí)。因此，我們的樣本可能包含不同復(fù)制周期階段的感染細(xì)胞混合物。在感染細(xì)胞的外圍收集CryoET傾斜系列。然后將載網(wǎng)轉(zhuǎn)移到FIB/SEM雙束電鏡上，用連續(xù)冷凍FIB/SEM體積成像法對(duì)相同的感染細(xì)胞進(jìn)行成像，或冷凍FIB銑切目標(biāo)區(qū)域的細(xì)胞薄片，以便收集額外的cryoET傾斜系列。同時(shí)，我們通過(guò)軟X射線冷凍斷層掃描對(duì)其他感染細(xì)胞進(jìn)行了成像。受感染和未受感染細(xì)胞的定量和相關(guān)數(shù)據(jù)集，以及不同觀察結(jié)果的定量分析，在補(bǔ)充表1中予以總結(jié)。這些成像模式在不同長(zhǎng)度尺度上提供了必要的結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)信息，以便在其細(xì)胞環(huán)境中可視化感染病毒，并且具有高度互補(bǔ)性。事實(shí)上，這種獨(dú)特的方法能夠以多模式、多尺度和相關(guān)的方式直接可視化SARS-CoV-2復(fù)制和細(xì)胞病變效應(yīng)。

與未感染細(xì)胞相比（補(bǔ)充圖2和補(bǔ)充影片1），五個(gè)SARS-CoV-2感染細(xì)胞的連續(xù)冷凍FIB/SEM全細(xì)胞成像顯示了廣泛的細(xì)胞病理學(xué)改變，如圖1和補(bǔ)充影片2-6所示。在細(xì)胞外圍，有許多電子致密顆粒，其大小與SARS-CoV-2病毒一致（圖1A，黑色箭頭）。觀察到許多膜隧道狀結(jié)構(gòu)從細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)深入細(xì)胞，含有病毒樣顆粒（圖1A，“T”和補(bǔ)充影片2）。這些隧道狀結(jié)構(gòu)類似于在HIV-1感染的巨噬細(xì)胞中觀察到的結(jié)構(gòu)，病毒通過(guò)這些結(jié)構(gòu)離開感染的細(xì)胞。此外，在與細(xì)胞膜不相連的細(xì)胞內(nèi)小泡中也發(fā)現(xiàn)了電子密集的病毒樣顆粒（圖1A，紅色箭頭）。在細(xì)胞深處，我們發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞質(zhì)（圖1B），尤其是核周區(qū)域（圖1C）被大量小泡“V”占據(jù)（補(bǔ)充影片2-5）。SARS-CoV-2感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞中的核孔清晰可辨（圖1C和補(bǔ)充圖2A，C，藍(lán)色箭頭）。我們?cè)诟腥镜募?xì)胞中觀察到電子致密的復(fù)合膜室（圖1B，粉紅色箭頭）。先前已經(jīng)觀察到類似的結(jié)構(gòu)，并將其描述為在染色的塑料包埋細(xì)胞的薄切片中的大型含病毒囊泡（LVCV）。與對(duì)照細(xì)胞相比，在感染細(xì)胞中觀察到的一個(gè)更顯著的特征是細(xì)胞核的細(xì)胞病變損傷，在極端情況下，近一半的細(xì)胞核被內(nèi)陷的細(xì)胞質(zhì)占據(jù)（圖1D，補(bǔ)充影片6和補(bǔ)充圖3G）。在SARS-CoV-2感染的肺細(xì)胞和腸細(xì)胞的染色塑料切片的電鏡觀察中也注意到這種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陷，這表明SARS-CoV-2感染具有強(qiáng)烈的細(xì)胞病變效應(yīng)。

利用軟X射線冷凍斷層掃描提供的高通量全細(xì)胞成像能力，我們分析了5個(gè)感染細(xì)胞，這些細(xì)胞通過(guò)冷凍ET成像在細(xì)胞外圍識(shí)別并確認(rèn)SARS-CoV-2感染，另外還有12個(gè)來(lái)自對(duì)照網(wǎng)格的未感染細(xì)胞。在整個(gè)細(xì)胞水平上，軟X射線圖像顯示了線粒體的實(shí)質(zhì)性變化，因?yàn)樵谖锤腥炯?xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中存在長(zhǎng)管狀線粒體（補(bǔ)充圖3A，C，黃色箭頭），在感染細(xì)胞中很少見到（補(bǔ)充圖3B，D）。我們觀察到SARS-CoV-2感染細(xì)胞中線粒體的數(shù)量顯著減少（SARS-CoV感染細(xì)胞中每斷層圖像15.4±10.2，對(duì)照細(xì)胞中91.3±32，p=0.0001；補(bǔ)充圖4A）。這與先前描述SARS-CoV-2感染肺細(xì)胞導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)改變的研究結(jié)果一致。對(duì)三個(gè)感染細(xì)胞和兩個(gè)未感染細(xì)胞的人工分割的全細(xì)胞冷凍FIB/SEM體積的測(cè)量表明，SARS-CoV-2感染細(xì)胞中線粒體的長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照細(xì)胞（SARS-CoV-2感染細(xì)胞的線粒體長(zhǎng)度為0.60±0.70μm，對(duì)照細(xì)胞為0.90±1.14μm；p=0.0012；補(bǔ)充圖4B），線粒體體積沒有顯著減少（SARS-CoV-2感染的細(xì)胞為0.058±0.196μm3，對(duì)照細(xì)胞為0.141±0.763μm3，p=0.113；補(bǔ)充圖4C），表明線粒體形態(tài)發(fā)生了變化。我們還在核周區(qū)域觀察到許多小泡（補(bǔ)充圖3F），其大小與感染細(xì)胞中的DMV和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陷（補(bǔ)充圖3G）一致�？傊�，這些冷凍成像結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)展了先前與SARS-CoV-2感染相關(guān)的細(xì)胞病理學(xué)改變的發(fā)現(xiàn)。

討論
我們使用相關(guān)方法對(duì)近天然玻璃化細(xì)胞中SARS-CoV-2感染進(jìn)行成像，包括從整個(gè)細(xì)胞水平到亞細(xì)胞和分子水平的多個(gè)空間尺度。這種方法產(chǎn)生了感染過(guò)程的整體視圖，描述了病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變及其與原位結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。至關(guān)重要的是，通過(guò)該工作流實(shí)現(xiàn)的多尺度成像數(shù)據(jù)的整合（補(bǔ)充圖1）使我們能夠在感染細(xì)胞的細(xì)胞病變后果的背景下直接可視化SARS-CoV-2復(fù)制的結(jié)構(gòu)事件。鑒于先前研究中對(duì)SARS-CoV-2和其他冠狀病毒的先驗(yàn)知識(shí)，這些圖像使我們提出了SARS-CoV-2復(fù)制的增強(qiáng)模型，特別是病毒基因組復(fù)制、組裝和出口，如下所述。SARS-CoV-2復(fù)制過(guò)程的圖像顯示，它是一個(gè)空間組織良好且高效的過(guò)程。從基因組復(fù)制到蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸，再到病毒組裝和出芽，每一步都發(fā)生在特定目的的緊密聯(lián)系的細(xì)胞質(zhì)隔間中。如圖6所示，RNA復(fù)制，包括基因組vRNA和亞基因組mRNA，發(fā)生在DMV中，將其從宿主細(xì)胞固有免疫應(yīng)答中分離出來(lái)（步驟1）。然后，新合成的vRNA通過(guò)跨膜入口從DMV運(yùn)輸?shù)竭@些DMV附近的病毒組裝位點(diǎn)（步驟2a），而mRNA通過(guò)相同的入口排出到細(xì)胞質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移到ER/Golgi以產(chǎn)生蛋白質(zhì)（步驟2b）。在ER/Golgi網(wǎng)絡(luò)中產(chǎn)生的三聚體預(yù)融合形式的病毒尖峰通過(guò)小的運(yùn)輸囊泡運(yùn)輸?shù)浇M裝位點(diǎn)（步驟3）。這些囊泡與SMV膜融合，其中在存在vRNA和N蛋白的情況下，病毒尖峰聚集在組裝位點(diǎn)，導(dǎo)致正的膜彎曲，并最終將病毒粒子萌發(fā)到SMV中（步驟4）。組裝和出芽過(guò)程產(chǎn)生含有病毒的囊泡，囊泡可以含有多種病毒顆粒。然后，病毒顆�？梢酝ㄟ^(guò)通道排出，可能通過(guò)溶酶體胞吐（步驟5）。該模型的某些方面仍然是推測(cè)性的，需要在未來(lái)的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

對(duì)SARS-CoV-2病毒在細(xì)胞內(nèi)傳播過(guò)程中的基因組復(fù)制、組裝和排出過(guò)程進(jìn)行多尺度觀察，對(duì)于促進(jìn)我們對(duì)這種病原體的理解至關(guān)重要，因?yàn)樗�具有闡明新信息和激發(fā)醫(yī)學(xué)干預(yù)以阻止生產(chǎn)性感染的手段。這一過(guò)程的許多方面有待進(jìn)一步研究，以剖析SARS-CoV-2復(fù)制的分子機(jī)制，包括其他病毒蛋白（如M和E）以及宿主蛋白和核心機(jī)構(gòu)的作用。這項(xiàng)研究提供了SARS-CoV-2復(fù)制周期在接近自然條件下的直接觀察，以及直接來(lái)自細(xì)胞組裝和細(xì)胞外釋放的病毒顆粒的融合前尖峰的結(jié)構(gòu)。通過(guò)這項(xiàng)研究開發(fā)的獨(dú)特方法和工作流程可廣泛應(yīng)用于SARS-CoV-2以外的其他人類病原體感染過(guò)程的研究。

科學(xué)家團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)介