在漫長(zhǎng)而充滿挑戰(zhàn)的藥物研發(fā)過(guò)程中，需要通過(guò)確定候選藥物對(duì)細(xì)胞靶點(diǎn)的親和力以及相互作用的動(dòng)力學(xué)來(lái)篩選候選藥物。表面等離子體共振（SPR）、生物膜干涉測(cè)量法（BLI）、石英晶體微天平（QCM）和表面聲波（SAW）等多種有標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記的方法被用于對(duì)從細(xì)胞中提取的或重組表達(dá)分離的蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。這些技術(shù)要求將提純的蛋白質(zhì)固定在傳感器表面，以便測(cè)量其與溶液中分析物的相互作用。

不幸的是，異源蛋白的表達(dá)和純化很繁瑣，并引入不確定性，如天然構(gòu)象的改變，這可能會(huì)改變表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)和行為。此外，由于各種細(xì)胞異質(zhì)性因素，如細(xì)胞表型、生長(zhǎng)周期、膜的剛性、受體的可及性和構(gòu)象以及鄰近蛋白的影響，分離提純蛋白受體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)可能與細(xì)胞原位天然受體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)大不相同。天然蛋白受體與分離提純蛋白受體之間的這些生理差異及其對(duì)受體功能的潛在影響，使得基于細(xì)胞原位的相互作用分析方法更具藥理學(xué)相關(guān)性和生物學(xué)意義。
 

圖1，不同形式的抗HER2抗體與HER2分子結(jié)合示意圖

 有幾種方法可用于測(cè)量細(xì)胞天然受體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，如表面等離子體共振顯微鏡（SPRM）、配體示蹤劑（LT）和石英晶體微天平（QCM）。然而，SPRM 是唯一具有單細(xì)胞分辨率的技術(shù)，因此能夠直接解決細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題。這種固有的異質(zhì)性會(huì)產(chǎn)生范圍廣泛的結(jié)合相互作用行為，而不能像通常的做法那樣，簡(jiǎn)單地將整個(gè)細(xì)胞群的行為平均處理。

本案例對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體 2（HER2）的天然形式和重組形式的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)研究和比較。由于各種因素的影響，重組形式和天然形式的 HER2 受體的取向可能不同。圖 1 展示了通過(guò)（A）胺基偶聯(lián)固定在葡聚糖基質(zhì)芯片和（B）靜電作用固定在培養(yǎng)皿上的 HER2 重組蛋白。固定化后，重組 HER2（rHER2）受體的結(jié)構(gòu)域 IV 可及性更好。然而，細(xì)胞原位天然受體HER2是定向的，結(jié)合結(jié)構(gòu)域 IV 非�？拷�(C)活細(xì)胞和(D)固定細(xì)胞的細(xì)胞膜。因此，細(xì)胞膜可以通過(guò)對(duì)抗體施加一定的立體位阻影響相互作用。通過(guò)對(duì)不同受體方向的觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)，提純的重組 HER2 受體固定后，結(jié)合域 IV 比其天然形式更容易接近。

利用 SPRm200 系統(tǒng)研究了抗 HER2 抗體與 SKBR3 細(xì)胞原位的 HER2 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，并與分離提純的 rHER2 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了比較。培養(yǎng) SKBR3 細(xì)胞并讓其附著于二分之一的聚賴氨酸涂層傳感器表面（圖 2A）；另一半傳感器表面用作參照區(qū)。進(jìn)行系列動(dòng)力學(xué)滴定注射，使細(xì)胞先后暴露于6種濃度的anti-HER2-FITC 溶液（1.00、5.00、10.00、20.00 和 50.00 nM）中。

                                  圖2，SPRm200細(xì)胞原位分子互作動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)分析

ImageSPR™ 軟件用于分析 SPRM 傳感圖。圖 2B 顯示了單個(gè)感興趣區(qū) (ROI) 的代表性結(jié)合反應(yīng)。對(duì)藍(lán)色 ROI 中觀察到的結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行分析，以生成圖 2C-E 中的結(jié)合直方圖。對(duì)直方圖進(jìn)行高斯分布擬合，以確定每個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的平均值和 95% 的置信區(qū)間�？贵w與天然 HER2 受體之間的結(jié)合相互作用遵循 1:2 結(jié)合模型。這一觀察與先前的研究結(jié)果非常吻合，先前的研究表明赫賽汀與天然和糖基化的 HER2 受體的結(jié)構(gòu)域 IV 的結(jié)合方式為 1:2 結(jié)合，與非糖基化受體的結(jié)合力更強(qiáng)，而與糖基化受體的結(jié)合力更弱。

將從 SKBR3 細(xì)胞的天然受體獲得的動(dòng)力學(xué)相互作用值與從提純、固定的重組受體獲得的值進(jìn)行了比較。對(duì)重組受體rHER2 蛋白的結(jié)合研究是在采用 BI-DirectFlow™ 技術(shù)的五通道 BI-4500A SPR 系統(tǒng)上進(jìn)行的。rHER2 分子通過(guò)胺基偶聯(lián)固定在羧甲基葡聚糖（CM-葡聚糖）傳感器芯片上。

                   圖3，BI-4500A多功能分子互作分析儀實(shí)驗(yàn)分析

由于 rHER2 受體上缺乏糖基化修飾，因此采用更簡(jiǎn)單的 1:1 相互作用動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析（圖 3）。如表 1 所示，與重組受體相比，細(xì)胞內(nèi)天然受體的結(jié)合速率較慢。這一點(diǎn)在第二組細(xì)胞原位動(dòng)力學(xué)峰上表現(xiàn)得尤為明顯，這些峰歸因于糖基化，其結(jié)合率慢約 3.5 倍，親和力弱約 17 倍。我們懷疑提純的 rHER2受體固定后的取向和缺乏糖基化阻礙有助于提高 rHER2 受體結(jié)合域 IV 的可及性，從而使抗體結(jié)合速率更快，親和力更強(qiáng)。

                   表1，抗 HER2 抗體與細(xì)胞原位HER2和重組 HER2 相互作用測(cè)得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本案例在細(xì)胞原位天然蛋白受體形式和固定重組蛋白受體形式之間觀察到了截然不同的相互作用行為。這些差異凸顯了基于細(xì)胞原位的分子互作動(dòng)力學(xué)研究對(duì)藥物開(kāi)發(fā)的重要性，從而能更全面地評(píng)估藥效、生物相關(guān)藥效代動(dòng)力學(xué)和基本的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。

SPRm200系統(tǒng)將光學(xué)顯微鏡與分子互作技術(shù)相結(jié)合，專為觀察和測(cè)量細(xì)胞膜表面蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合親和力及動(dòng)力學(xué)常數(shù)設(shè)計(jì)，為分子相互作用的研究開(kāi)辟了新的前沿。

(1)SPRm200系統(tǒng)無(wú)需對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，可以實(shí)時(shí)定量的進(jìn)行檢測(cè)；

(2)可同時(shí)可視化觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和局部結(jié)合活性；

(3)無(wú)需提取細(xì)胞膜蛋白，即可在正�；罴�(xì)胞狀態(tài)下觀察和測(cè)量藥物和膜蛋白的實(shí)時(shí)相互作用；

(4)探測(cè)器測(cè)量每個(gè)像素的SPR響應(yīng)，并將其映射到SPR圖像中，在每個(gè)像素處，記錄一個(gè)傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術(shù)使在自然條件下研究細(xì)胞表面膜蛋白與其他目標(biāo)分子結(jié)合和相互作用成為可能。SPRm200細(xì)胞原位分子互作動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)憑借其卓越的靈敏度和穩(wěn)定性，助力科學(xué)研究新發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)藥物開(kāi)發(fā)新高度。

參考文獻(xiàn)

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