應用分享：高通量電穿孔系統(tǒng)助力體外基因編輯、新藥開發(fā)、新冠研究
一，正序—體外基因編輯療法
電穿孔方法進行T細胞基因編輯的瓶頸：電穿孔技術在以往研究中發(fā)現(xiàn)，當加入長的雙鏈DNA以及濃度非常高的情況下，會對細胞造成很高的毒性引發(fā)細胞死亡，短的單鏈DNA就不會。
Theo及其團隊選擇Lonza 96 shuttle高通量電穿孔系統(tǒng)對CRISPR與DNA的比例、細胞培養(yǎng)的不同方式、不同強度的電脈沖等參數(shù)進行摸索優(yōu)化，很好的解決了雙鏈DNA對細胞毒性大的問題。Theo等從健康人體內(nèi)獲得T細胞，利用Lonza Nucleofector技術更換了T細胞的TCR，使這些細胞能夠特異性地攻擊人黑色素瘤細胞。
二，新藥開發(fā)—全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選
2019年，GSK（英國葛蘭素史克公司GlaxoSmithKline）公司與加州大學創(chuàng)建了基因組研究實驗室（LGR）。
SLAS2020國際會議與展覽在T細胞中進行陣列CRISPR-Cas9基因編輯篩選的384孔工作流程。
基于這一用于T細胞篩選的小型、穩(wěn)健的高通量電轉(zhuǎn)染方案和分析，GSK成功解決了原代T細胞的轉(zhuǎn)染難題，并展示了全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選在原代細胞轉(zhuǎn)染中的潛力。
三，新冠研究—高通量CRISPR篩選
加州大學舊金山分校的研究團隊使用Lonza 384-well Nucleofector™ 來進行陣列CRISPR篩選，以識別增強或抑制新冠病毒感染的宿主蛋白。
Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms[J]. Science (New York, N.Y.), 370(6521):eabe9403.
四，新冠研究—高通量CRISPR篩選
巴斯德研究所的研究團隊同樣應用到了Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行高通量的CRISPR/Cas9篩選，評估了1905個ISG（IFN stimulated genes）在人肺上皮細胞中調(diào)節(jié)SARS-Cov-2復制的能力。
Mac Kain, A., Maarifi, G., Aicher, S. et al. 2021. Identification of DAXX As A Restriction Factor Of SARS-CoV-2 Through A CRISPR/Cas9 Screen.
五，siRNA篩選靶點——開發(fā)腦瘤候選藥物
丹麥癌癥協(xié)會研究中心的研究人員基于Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行了高通量siRNA文庫篩選，采用的siRNA庫包含296個基因靶點，陽性對照（INCENP9）和陰性對照(siRNA的加擾對照)，每個基因設計了3個獨立的 siRNA�；诖�，研究人員發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細胞瘤的潛在靶點——SPT6，并證實了SPT6丟失誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）是膠質(zhì)母細胞瘤特異性的。
Obara E , Aguilar-Morante D , Rasmussen R D , et al. SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):4709.
六，原代細胞轉(zhuǎn)染——特發(fā)性肺纖維化治療
阿斯利康采用Lonza原代細胞，IPF肺成纖維細胞，探索了IPF(特發(fā)性肺纖維化Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)的關鍵疾病驅(qū)動機制。在這項研究中，Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)成功對原代健康人類肺成纖維細胞的第2代細胞進行了CRISPR-Cas9 RNP轉(zhuǎn)染遞送。研究結果證明了PPP1R15A在調(diào)節(jié)肺間充質(zhì)細胞中的主要作用，并且提示了特發(fā)性肺纖維化的一種新治療策略。
Monkley S , Overed-Sayer C , Parfrey H , et al. Sensitization of the UPR by Loss of PPP1R15A Promotes Fibrosis and Senescence in IPF[J]. Scientific Reports.
七，多質(zhì)粒的高通量電穿孔，優(yōu)化CRISPR堿基編輯
上海交通大學童垚俊教授團隊開發(fā)了一種基于CRISPR-Prime編輯技術的通用（無雙鏈斷裂）原核生物遺傳操作工具箱，通過Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進行高通量的多質(zhì)粒電穿孔，實現(xiàn)了大腸桿菌的質(zhì)粒和染色體的基因敲除、敲入、敲低、單堿基替換和組合編輯。
Tong, Y., Jørgensen, T.S., Whitford, C.M. et al. A versatile genetic engineering toolkit for E. coli based on CRISPR-prime editing. Nat Commun 12, 5206 (2021)
