背景
丹參(Lamiaceae)是用于治胸痹癥、心絞痛的傳統(tǒng)中藥。瞬時受體電位通道1 (Transient receptor potential canonical channel 1, TRPC1)是心肌損傷治療的重要靶點。

目的
篩選丹參中作用于TRPC1的活性成分。

材料與方法
采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，參照Lipinski的五法則，檢索丹參化合物庫進行初步篩選。然后，以TRPC1蛋白為基礎(chǔ)，用AutoDock Vina軟件對化合物組進行綜合評分。利用表面等離子體共振(SPR)測定了最佳化合物與TRPC1蛋白的親和力。采用Western blot方法觀察最佳化合物對HL-1細胞TRPC1蛋白表達的影響，采用Fura-2/AM檢測觀察最佳化合物對HEK293細胞鈣離子內(nèi)流的影響。

結(jié)果：同源建模
TRPC5蛋白是TRPC家族成員，已知有蛋白晶體結(jié)構(gòu)。TRPC1與TRPC5相似度46.33%。研究者以TRPC5晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，作了TRPC1的同源建模；利用POCASA預(yù)測了TRPC1蛋白的活性口袋。
 

圖1  POCASA預(yù)測TRPC1蛋白活性口袋。紫色區(qū)域代表潛在活性位點

虛擬篩選&分子對接
采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，參照Lipinski的五規(guī)則【分子量小于500Da；不超過5個氫鍵供體；不超過10個氫鍵受體；辛醇-水分配系數(shù)（Clog P）不超過5；口服生物利用度大于50%】以及類藥性大于0.18，檢索丹參化合物庫進行初步篩選，從202個化合物中發(fā)現(xiàn)有20個化合物有良好的特征參數(shù)。然后利用AutoDock Vina軟件對這20個化合物進行計算；通過配體受體間形狀匹配與結(jié)合能量等參數(shù)進行評分。分子對接結(jié)果顯示，其中迷迭香酸（Rosmarinic acid）得分最高。
 

圖2  RosA 與 TRPC1分子對接圖譜

親和力測定
小分子化合物RosA與TRPC1蛋白是否會發(fā)生結(jié)合呢？研究者采用SPR技術(shù)，利用P4SPR分子互作儀對RosA與TRPC1蛋白作了結(jié)合驗證以及親和力測量。檢測發(fā)現(xiàn)，RosA與TRPC1蛋白的親和力KD值為1.27uM；同時對照組TRPC1蛋白與TRCP1抗體的KD值是0.05 uM；TRPC1蛋白與抑制劑SKF96365的KD值是200uM。結(jié)果顯示RosA可直接結(jié)合于TRPC1蛋白。
 

圖3  RosA與TPPC1蛋白的SPR結(jié)合曲線

活性評價
研究者進一步采用Western blot方法觀察最佳化合物RosA對HL-1細胞TRPC1蛋白表達的影響，RosA (50uM)可降低HL-1細胞氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)后TRPC1蛋白水平(417.1%)，而對正常組沒有影響。
 

圖4  RosA抑制HL-1細胞OGD/R 損傷后TRPC1蛋白水平

TRPC1蛋白屬于離子通道蛋白家族，研究者又采用Fura-2/AM方法檢測觀察最佳化合物RosA對HEK293細胞鈣離子內(nèi)流的影響，發(fā)現(xiàn)RosA可抑制HEK293細胞中TRPC1蛋白介導的Ca2+內(nèi)流損傷(0.07 Fura-2 Ratio340/380)。

圖5  RosA抑制HEK293細胞中TRPC1蛋白介導的Ca²⁺內(nèi)流

討論與結(jié)論
研究者利用“同源建模-虛擬篩選-分子對接-親和力測定-活性評價”的方法，從傳統(tǒng)中藥丹參化合物庫中獲得了作用于TRPC1的潛在活性成分RosA，推測RosA可能是一種有前景的心肌損傷治療臨床候選藥物。

文中“親和力測定”環(huán)節(jié)采用了P4SPR個人型分子互作

P4SPR優(yōu)勢
Affinité instruments 的 P4SPR 是一款模塊化、個人型的多通道分子互作系統(tǒng)，既可用于生物學機制的解析，也可用于藥物篩選的驗證。它的模塊化設(shè)計允許與液流傳輸系統(tǒng)輕松集成。多通道特性提高了測量精度，其靈敏度允許檢測低分子量的小分子。特異性強、靈敏度高且用戶友好的P4SPR 系統(tǒng)可以用于快速收集SPR 數(shù)據(jù)來表征兩分子間結(jié)合的相互作用，非常適合用于對生物功能背后作用機制的探索以及藥物篩選等研究。

參考文獻
1,A CD36 ectodomain mediates insect pheromone detection via a putative tunnelling mechanism, Nature Communications,Richard Benton etc.

2, Screening of rosmarinic acid from Salvia miltiorrhizaeacting on the novel target TRPC1 based on the‘homology modelling–virtual screening–molecular docking–affinity assay–activity evaluation’ method, PHARMACEUTICAL BIOLOGY.