脊髓損傷是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球每年新增病例超過50萬例。由于神經(jīng)回路重建困難以及病灶區(qū)周圍惡劣的組織微環(huán)境，通常導(dǎo)致患者的不良預(yù)后。目前，手術(shù)清創(chuàng)減壓以及激素療法是臨床上的常用手段，但該方案無益于重建受損的神經(jīng)回路。近些年的臨床前研究已經(jīng)開發(fā)出多種人工脊髓，然而，如何提高細(xì)胞移植物的活性和負(fù)載效率，如何規(guī)避干細(xì)胞在安全性和倫理性上的風(fēng)險(xiǎn)，如何簡化細(xì)胞接種過程以及制造標(biāo)準(zhǔn)化的水凝膠支架，從而開發(fā)一種更加符合臨床應(yīng)用場景的人工脊髓組織，一直是該領(lǐng)域亟待解決的問題。

近期，浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院余路陽教授團(tuán)隊(duì)與浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院賀永教授團(tuán)隊(duì)合作，圍繞構(gòu)建適合臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的人工脊髓這一科學(xué)問題，基于高精度光固化3D打印水凝膠支架以及人羊膜上皮干細(xì)胞（hAESCs）這類新型圍產(chǎn)期干細(xì)胞，同時(shí)開發(fā)新型后處理工藝，實(shí)現(xiàn)了水凝膠支架對于細(xì)胞移植物的自促進(jìn)吸收，極大簡化了細(xì)胞接種過程的操作難度，提高了細(xì)胞的負(fù)載量以及遞送效率。并發(fā)揮人羊膜上皮干細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)營養(yǎng)上的功能，在大鼠脊髓損傷模型的修復(fù)中展現(xiàn)出較高的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用潛力。相關(guān)工作“A 3D-Printed Dual Driving Forces Scaffold with Self-Promoted Cell Absorption for Spinal Cord Injury Repair”發(fā)表于《Advanced Science》雜志。


圖1 具有自促進(jìn)吸附能力的脊髓支架的設(shè)計(jì)和制造思路

1. 開發(fā)雙驅(qū)動(dòng)力模型及后處理工藝
隨著3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了越來越多具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架產(chǎn)品。然而，由于重力以及支架內(nèi)部復(fù)雜結(jié)構(gòu)所帶來的高流阻特性，使得常規(guī)細(xì)胞接種方法無法獲得令人滿意的支架表面利用率以及細(xì)胞的均勻分布。對于載細(xì)胞打印而言，不可避免的會(huì)對細(xì)胞活性以及狀態(tài)造成影響。因此，作者提出了分離支架制造與細(xì)胞接種過程，開發(fā)新型后處理工藝的思路。

通過組合烘干干燥和冷凍干燥各自的優(yōu)點(diǎn)，作者開發(fā)了一種具有宏觀+微觀吸收力的后處理方法，并解釋了其作用機(jī)理。具體來說，水凝膠支架中75%的水分通過烘干干燥去除后，支架的宏觀體積會(huì)大大縮小，從而能夠在復(fù)水過程中給予細(xì)胞最大的吸收力；而剩余水分將利用冷凍干燥方法去除，從而使得支架遍布相互連通的微小空隙，各個(gè)方向的毛細(xì)作用能夠克服重力影響，使細(xì)胞能夠貼附在各方向的支架表面。結(jié)果顯示，經(jīng)過該方法處理后的水凝膠支架（HES）不僅具有良好的親水性和吸水速度，而且具有最大的體積膨脹程度，有利于細(xì)胞的吸附及負(fù)載。

圖2 雙驅(qū)動(dòng)力吸收模型的開發(fā)

2. 高效hAESCs遞送系統(tǒng)的開發(fā)
在雙驅(qū)動(dòng)力模型基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步檢測了HES支架負(fù)載細(xì)胞的能力。得益于HES支架強(qiáng)大的吸附能力，使得整個(gè)細(xì)胞吸收過程能夠在2分鐘內(nèi)完成，因此，作者展示了高載量HES-hAESCs輸送系統(tǒng)的實(shí)際操作過程。便利且標(biāo)準(zhǔn)化的操作過程有利于后續(xù)臨床前以及未來臨床轉(zhuǎn)化。熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了在HES支架上的均勻分布，且細(xì)胞能夠貼附到支架內(nèi)部各個(gè)方向的表面。定量結(jié)果顯示，HES支架的細(xì)胞負(fù)載能力極大提高，最終的細(xì)胞密度可達(dá)到5 × 10⁴ cells/mm³.


圖3 高載量和均勻分布的HES-hAESCs輸送系統(tǒng)

3. HES-hAESCs脊髓支架改善大鼠模型的后肢運(yùn)動(dòng)功能
接下來作者在大鼠脊髓損傷模型中探究HES-hAESCs脊髓支架的治療效果。結(jié)果顯示，移植8周后大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯改善，表現(xiàn)為后肢出現(xiàn)連續(xù)性的負(fù)重行走。電生理數(shù)據(jù)顯示，后肢肌肉電位恢復(fù)明顯，電信號振幅明顯增強(qiáng)，可恢復(fù)至正常大鼠的40%以上；另外，電信號延時(shí)明顯縮短，提示移植HES-hAESCs脊髓支架能夠明顯增強(qiáng)病灶區(qū)內(nèi)下行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)回路的重建。


圖4 HES-hAESCs改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能

4. HES-hAESCs脊髓支架促進(jìn)受損的神經(jīng)回路重建
隨后，作者進(jìn)一步檢測脊髓支架對于病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維的恢復(fù)作用。結(jié)果顯示，HES-hAESCs支架明顯增強(qiáng)病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維的延伸生長以及成熟程度，hAESCs的存在顯著提高了支架微孔道內(nèi)的神經(jīng)纖維數(shù)量，部分神經(jīng)纖維表達(dá)特定亞型神經(jīng)元標(biāo)志物，與行為學(xué)檢測結(jié)果相一致。另外，掃描電鏡結(jié)果顯示，HES-hAESCs組大鼠病灶區(qū)內(nèi)部神經(jīng)纖維的髓鞘化程度明顯提高，提示脊髓支架的存在能夠促進(jìn)神經(jīng)回路的重建以及進(jìn)一步成熟。


圖5 HES-hAESCs促進(jìn)病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維生長和髓鞘形成

綜上所述，雙驅(qū)動(dòng)力吸附模型為水凝膠支架實(shí)現(xiàn)自促進(jìn)的細(xì)胞接種吸收提供了新的方法與原理，HES支架作為一個(gè)強(qiáng)大的細(xì)胞遞送工具，為以hAESCs為代表的臨床級干細(xì)胞治療提供了新方法，具有極大的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202301639