Genentech團(tuán)隊(duì)篩選出新生抗原-HLA結(jié)合表位
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T細(xì)胞在消除癌細(xì)胞方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用1,2，增強(qiáng)內(nèi)源性腫瘤特異性T細(xì)胞活性(例如癌癥疫苗)或引入靶向新抗原的T細(xì)胞的免疫療法具有很好的臨床療效3,4。新抗原導(dǎo)向的治療方法需要腫瘤細(xì)胞表面具有可被HLA呈遞的新抗原表位，即由突變蛋白衍生的8 – 11個(gè)氨基酸多肽。T細(xì)胞受體(TCRs)在HLA復(fù)合物的背景下與同源肽相互作用，使得治療靶點(diǎn)既可以是新抗原表位序列又可以針對(duì)不同HLA的分型。盡管臨床前景看好，但新抗原特異性治療的應(yīng)用仍受到限制，尤其是可能是某些癌癥亞型的患者中共有的那些，被驗(yàn)證新抗原表位與HLA的結(jié)合的范圍是有限的。
1.高通量TR-FRET測(cè)定和NetMHCpan-4.0預(yù)測(cè)結(jié)合用于共有新抗原-HLA結(jié)合表位的發(fā)掘
圖1 高通量篩選新抗原表位的工作流程
2.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)47種癌癥共有新生抗原的I型HLA單等位基因細(xì)胞系
選擇HMy2.C1R (C1R) 淋巴母細(xì)胞，利用CRISPER-Cas9破壞其HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，生成HLA-null細(xì)胞群，并通過FACS將目標(biāo)細(xì)胞群富集出來。隨后，通過穩(wěn)定的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將15個(gè)HLA等位基因作為單個(gè)轉(zhuǎn)基因分別引入新抗原連接子表達(dá)和非連接子表達(dá)的C1R-HLAnull細(xì)胞系，最終共獲得30個(gè)細(xì)胞群。連接子和無連接子的新抗原工程細(xì)胞構(gòu)建時(shí)包含了一組相同的7個(gè)已知的HLA-A*02:01遞呈表位。并且，隨后的HLA-IP和靶向質(zhì)譜分析證實(shí)了連接子和非連接子HLA-A*02:01工程細(xì)胞中存在的兩種對(duì)照肽和前序報(bào)道的TP53 R175H23新抗原表位。
圖2 單等位基因工程細(xì)胞系的構(gòu)建
3.利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定單等位基因工程T細(xì)胞中的免疫多肽組
4.PRM靶向驗(yàn)證候選結(jié)合表位
首先通過TR-FRET RZ評(píng)分≥5初步篩選出397條多肽，然后結(jié)合NetMHC %Rank≤2和RZ評(píng)分< 5篩選出互補(bǔ)的81條，共計(jì)對(duì)479條候選的新抗原多肽進(jìn)行合成，然后通過PRM進(jìn)行靶向鑒定。結(jié)果共篩選出86個(gè)新抗原表位-HLA結(jié)合對(duì)和36條新生抗原肽。86個(gè)結(jié)合對(duì)中，有21個(gè)是已發(fā)表過的，65個(gè)是未曾報(bào)道的新發(fā)現(xiàn)，共55個(gè)被TR-FRET與NetMHC預(yù)測(cè)均認(rèn)定為預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。另外，通過與非靶向質(zhì)譜數(shù)據(jù)相比，靶向法能更好地識(shí)別出結(jié)合能力較弱的新表位，且能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
5.全長(zhǎng)蛋白的KRAS新抗原表位驗(yàn)證
為了驗(yàn)證由全長(zhǎng)突變蛋白加工生成的新生抗原肽，構(gòu)建了4個(gè)HLA-A*11:01單等位基因突變的C1R細(xì)胞系，包括全長(zhǎng)野生型、G12C、G12D或G12V突變的KRAS，并通過全細(xì)胞靶向蛋白組驗(yàn)證各自的信號(hào)肽。然后，將先前鑒定到的與HLA-1*11:01相關(guān)的兩個(gè)KRAS表位進(jìn)行富集和靶向定量。與全長(zhǎng)野生型細(xì)胞系相比，G12V和G12D的均被明顯誘導(dǎo)產(chǎn)生更多VVVGAVGVGK的結(jié)合表位。最后，在內(nèi)源性表達(dá)相關(guān)蛋白和HLA的細(xì)胞系中，進(jìn)一步驗(yàn)證了發(fā)現(xiàn)的候選新抗原結(jié)合表位。
6.腫瘤特異性抗原-HLA結(jié)合對(duì)的功能驗(yàn)證
采用了復(fù)合TCR發(fā)現(xiàn)法進(jìn)一步驗(yàn)證了通過該方案篩選出的新抗原表位可以被人的T細(xì)胞識(shí)別。以鑒定到的兩個(gè)新表位-HLA結(jié)合對(duì)(FLT3-p.D835Y/A*02:01, PIK3CA-p.E545K/A*11:01))為例，首先將新表位以獨(dú)特的組合分配到多肽庫(kù)中，然后使用自體單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞對(duì)健康人供體CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，接著用新表位肽庫(kù)重新激活T細(xì)胞，再通過激活標(biāo)志物排序，最后進(jìn)行TCRβ測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PIK3CA-p.E545K TCR能夠特異性識(shí)別突變的PIK3CA，并且有可能是潛在的治療靶點(diǎn)。
圖6 篩查新抗原-HLA結(jié)合對(duì)的特異性TCR以驗(yàn)證免疫原性
綜上所述，本研究創(chuàng)建了一個(gè)可擴(kuò)展的新抗原表位- HLA結(jié)合對(duì)的發(fā)現(xiàn)策略。首先選擇了47個(gè)癌癥突變和15個(gè)HLA等位基因來定義新抗原表位，并由此擴(kuò)展到假定的臨床靶點(diǎn)。然后，采用高通量HLA結(jié)合測(cè)定法5.6和NetMHCpan-4.07，在濕實(shí)驗(yàn)和計(jì)算預(yù)測(cè)兩個(gè)方面對(duì)新抗原-HLA結(jié)合對(duì)進(jìn)行篩選。針對(duì)上述方法觀察到的新抗原-HLA結(jié)合對(duì)，分別采用非靶向和靶向質(zhì)譜法(MS)對(duì)HLA單等位細(xì)胞系的免疫多肽組進(jìn)行分析，最終得到86個(gè)新抗原-HLA結(jié)合對(duì)。為了評(píng)估這些靶點(diǎn)的治療潛力，通過TCR證明了突變選擇性T細(xì)胞對(duì)有這些新抗原表達(dá)的細(xì)胞的靶向殺傷力。
目前在PEAKS的軟件中，針對(duì)多肽組分析，尤其是以免疫多肽為代表的應(yīng)用場(chǎng)景，我們已經(jīng)推出基于深度學(xué)習(xí)技術(shù)的DeepNovo Peptidome工作流，原有PEAKS de novo+ PEAKS DB的分析基礎(chǔ)上，通過氨基酸水平的置信度、保留時(shí)間和CCS值等預(yù)測(cè)，特別是巧妙地通過兩輪分析將從頭測(cè)序的多肽結(jié)果納入全局FDR的質(zhì)控，對(duì)于多肽組鑒定的靈敏度和準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高。
參考文獻(xiàn)：
1.Jhunjhunwala, S., Hammer, C. & Delamarre, L. Antigen presentation in cancer: insights into tumour immunogenicity and immune evasion. Nat. Rev. Cancer 21, 298–312 (2021).
2.Klebanoff, C. A. & Wolchok, J. D. Shared cancer neoantigens: making private matters public. J. Exp. Med. 215, 5–7 (2018).
3.Zhang, Z. et al. Neoantigen: a new breakthrough in tumor immunotherapy. Front. Immunol. 12, 672356 (2021).
4.Mei, S. et al. A comprehensive review and performance evaluation of bioinformatics tools for HLA class I peptide-binding prediction. Brief. Bioinform. 21, 1119–1135 (2020).
5.Darwish, M. et al. High‐throughput identification of conditional MHCI ligands and scaled‐up production of conditional MHCI complexes. Protein Sci. 30, 1169–1183 (2021).
6.Rodenko, B. et al. Generation of peptide–MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat. Protoc. 1, 1120–1132 (2006).
7.Jurtz, V. et al. NetMHCpan-4.0: improved peptide–MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. J. Immunol. 199, 3360–3368 (2017).
8.https://www.bioinfor.com/deepnovo-peptidome/
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2023年10月19日，來自全球第二大生物技術(shù)公司Genentech的研究團(tuán)隊(duì)，在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了一篇題為 Systematic discovery of neoepitope–HLA pairs for neoantigens shared among patients and tumor types的文章，他們發(fā)掘了86個(gè)具有免疫原性的候選新生抗原-HLA結(jié)合表位，本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)將非常有助于研究人員推動(dòng)在抗原加工以及新抗原表位靶向治療方面的研究進(jìn)展。本研究使用了PEAKS Online軟件完成了對(duì)工程T細(xì)胞系的全免疫多肽組質(zhì)譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、無偏鑒定。
T細(xì)胞在消除癌細(xì)胞方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用1,2，增強(qiáng)內(nèi)源性腫瘤特異性T細(xì)胞活性(例如癌癥疫苗)或引入靶向新抗原的T細(xì)胞的免疫療法具有很好的臨床療效3,4。新抗原導(dǎo)向的治療方法需要腫瘤細(xì)胞表面具有可被HLA呈遞的新抗原表位，即由突變蛋白衍生的8 – 11個(gè)氨基酸多肽。T細(xì)胞受體(TCRs)在HLA復(fù)合物的背景下與同源肽相互作用，使得治療靶點(diǎn)既可以是新抗原表位序列又可以針對(duì)不同HLA的分型。盡管臨床前景看好，但新抗原特異性治療的應(yīng)用仍受到限制，尤其是可能是某些癌癥亞型的患者中共有的那些，被驗(yàn)證新抗原表位與HLA的結(jié)合的范圍是有限的。
1.高通量TR-FRET測(cè)定和NetMHCpan-4.0預(yù)測(cè)結(jié)合用于共有新抗原-HLA結(jié)合表位的發(fā)掘
首先，通過臨床基因組學(xué)篩選出與36個(gè)候選新生抗原結(jié)合的16個(gè)HLA分型，然后結(jié)合時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（TR-FRET）和NetMHCpan-4.0的預(yù)測(cè)功能對(duì)候選的抗原結(jié)合表位與HLA-多肽復(fù)合物進(jìn)行表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法約有30%左右的一致性，且各有優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際研究中，可以結(jié)合這兩種方法進(jìn)行新抗原表位的全面發(fā)掘。
圖1 高通量篩選新抗原表位的工作流程2.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)47種癌癥共有新生抗原的I型HLA單等位基因細(xì)胞系
選擇HMy2.C1R (C1R) 淋巴母細(xì)胞，利用CRISPER-Cas9破壞其HLA-C等位基因(HLA-C*04:01)，生成HLA-null細(xì)胞群，并通過FACS將目標(biāo)細(xì)胞群富集出來。隨后，通過穩(wěn)定的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將15個(gè)HLA等位基因作為單個(gè)轉(zhuǎn)基因分別引入新抗原連接子表達(dá)和非連接子表達(dá)的C1R-HLAnull細(xì)胞系，最終共獲得30個(gè)細(xì)胞群。連接子和無連接子的新抗原工程細(xì)胞構(gòu)建時(shí)包含了一組相同的7個(gè)已知的HLA-A*02:01遞呈表位。并且，隨后的HLA-IP和靶向質(zhì)譜分析證實(shí)了連接子和非連接子HLA-A*02:01工程細(xì)胞中存在的兩種對(duì)照肽和前序報(bào)道的TP53 R175H23新抗原表位。
圖2 單等位基因工程細(xì)胞系的構(gòu)建工程T細(xì)胞構(gòu)建成功后，通過IP富集出I類HLA多肽，然后通過質(zhì)譜進(jìn)行DDA鑒定，得到的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)通過PEAKS Online軟件完成分析，最終在各個(gè)細(xì)胞群中分別鑒定出218-6663個(gè)特異的長(zhǎng)度在8-11個(gè)氨基酸的肽段，且每個(gè)等位基因?qū)?yīng)的多肽都符合已知基序。在非靶向質(zhì)譜的結(jié)果中，觀察到22個(gè)新抗原-HLA結(jié)合表位，與5個(gè)HLA分型中的15個(gè)共有新生抗原相對(duì)應(yīng)，并且這22個(gè)表位在TR-FRET和NetMHC中的預(yù)測(cè)一致性非常高，其中有17個(gè)在兩種預(yù)測(cè)方法中都被認(rèn)定為結(jié)合位點(diǎn)。
圖3 工程T細(xì)胞免疫多肽組的質(zhì)譜鑒定
4.PRM靶向驗(yàn)證候選結(jié)合表位
首先通過TR-FRET RZ評(píng)分≥5初步篩選出397條多肽，然后結(jié)合NetMHC %Rank≤2和RZ評(píng)分< 5篩選出互補(bǔ)的81條，共計(jì)對(duì)479條候選的新抗原多肽進(jìn)行合成，然后通過PRM進(jìn)行靶向鑒定。結(jié)果共篩選出86個(gè)新抗原表位-HLA結(jié)合對(duì)和36條新生抗原肽。86個(gè)結(jié)合對(duì)中，有21個(gè)是已發(fā)表過的，65個(gè)是未曾報(bào)道的新發(fā)現(xiàn)，共55個(gè)被TR-FRET與NetMHC預(yù)測(cè)均認(rèn)定為預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。另外，通過與非靶向質(zhì)譜數(shù)據(jù)相比，靶向法能更好地識(shí)別出結(jié)合能力較弱的新表位，且能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。
圖4 靶向質(zhì)譜法驗(yàn)證工程T細(xì)胞的免疫多肽組
5.全長(zhǎng)蛋白的KRAS新抗原表位驗(yàn)證
為了驗(yàn)證由全長(zhǎng)突變蛋白加工生成的新生抗原肽，構(gòu)建了4個(gè)HLA-A*11:01單等位基因突變的C1R細(xì)胞系，包括全長(zhǎng)野生型、G12C、G12D或G12V突變的KRAS，并通過全細(xì)胞靶向蛋白組驗(yàn)證各自的信號(hào)肽。然后，將先前鑒定到的與HLA-1*11:01相關(guān)的兩個(gè)KRAS表位進(jìn)行富集和靶向定量。與全長(zhǎng)野生型細(xì)胞系相比，G12V和G12D的均被明顯誘導(dǎo)產(chǎn)生更多VVVGAVGVGK的結(jié)合表位。最后，在內(nèi)源性表達(dá)相關(guān)蛋白和HLA的細(xì)胞系中，進(jìn)一步驗(yàn)證了發(fā)現(xiàn)的候選新抗原結(jié)合表位。
圖5 全長(zhǎng)蛋白新抗原表位驗(yàn)證
6.腫瘤特異性抗原-HLA結(jié)合對(duì)的功能驗(yàn)證
采用了復(fù)合TCR發(fā)現(xiàn)法進(jìn)一步驗(yàn)證了通過該方案篩選出的新抗原表位可以被人的T細(xì)胞識(shí)別。以鑒定到的兩個(gè)新表位-HLA結(jié)合對(duì)(FLT3-p.D835Y/A*02:01, PIK3CA-p.E545K/A*11:01))為例，首先將新表位以獨(dú)特的組合分配到多肽庫(kù)中，然后使用自體單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞對(duì)健康人供體CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，接著用新表位肽庫(kù)重新激活T細(xì)胞，再通過激活標(biāo)志物排序，最后進(jìn)行TCRβ測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，PIK3CA-p.E545K TCR能夠特異性識(shí)別突變的PIK3CA，并且有可能是潛在的治療靶點(diǎn)。
圖6 篩查新抗原-HLA結(jié)合對(duì)的特異性TCR以驗(yàn)證免疫原性綜上所述，本研究創(chuàng)建了一個(gè)可擴(kuò)展的新抗原表位- HLA結(jié)合對(duì)的發(fā)現(xiàn)策略。首先選擇了47個(gè)癌癥突變和15個(gè)HLA等位基因來定義新抗原表位，并由此擴(kuò)展到假定的臨床靶點(diǎn)。然后，采用高通量HLA結(jié)合測(cè)定法5.6和NetMHCpan-4.07，在濕實(shí)驗(yàn)和計(jì)算預(yù)測(cè)兩個(gè)方面對(duì)新抗原-HLA結(jié)合對(duì)進(jìn)行篩選。針對(duì)上述方法觀察到的新抗原-HLA結(jié)合對(duì)，分別采用非靶向和靶向質(zhì)譜法(MS)對(duì)HLA單等位細(xì)胞系的免疫多肽組進(jìn)行分析，最終得到86個(gè)新抗原-HLA結(jié)合對(duì)。為了評(píng)估這些靶點(diǎn)的治療潛力，通過TCR證明了突變選擇性T細(xì)胞對(duì)有這些新抗原表達(dá)的細(xì)胞的靶向殺傷力。
目前在PEAKS的軟件中，針對(duì)多肽組分析，尤其是以免疫多肽為代表的應(yīng)用場(chǎng)景，我們已經(jīng)推出基于深度學(xué)習(xí)技術(shù)的DeepNovo Peptidome工作流，原有PEAKS de novo+ PEAKS DB的分析基礎(chǔ)上，通過氨基酸水平的置信度、保留時(shí)間和CCS值等預(yù)測(cè)，特別是巧妙地通過兩輪分析將從頭測(cè)序的多肽結(jié)果納入全局FDR的質(zhì)控，對(duì)于多肽組鑒定的靈敏度和準(zhǔn)確度進(jìn)一步提高。
參考文獻(xiàn)：
1.Jhunjhunwala, S., Hammer, C. & Delamarre, L. Antigen presentation in cancer: insights into tumour immunogenicity and immune evasion. Nat. Rev. Cancer 21, 298–312 (2021).
2.Klebanoff, C. A. & Wolchok, J. D. Shared cancer neoantigens: making private matters public. J. Exp. Med. 215, 5–7 (2018).
3.Zhang, Z. et al. Neoantigen: a new breakthrough in tumor immunotherapy. Front. Immunol. 12, 672356 (2021).
4.Mei, S. et al. A comprehensive review and performance evaluation of bioinformatics tools for HLA class I peptide-binding prediction. Brief. Bioinform. 21, 1119–1135 (2020).
5.Darwish, M. et al. High‐throughput identification of conditional MHCI ligands and scaled‐up production of conditional MHCI complexes. Protein Sci. 30, 1169–1183 (2021).
6.Rodenko, B. et al. Generation of peptide–MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat. Protoc. 1, 1120–1132 (2006).
7.Jurtz, V. et al. NetMHCpan-4.0: improved peptide–MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. J. Immunol. 199, 3360–3368 (2017).
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