為保護(hù)人們免受流感病毒感染，并減少與流感有關(guān)的死亡人數(shù)，生物制品公司每年都需要生產(chǎn)流感疫苗。因此，相關(guān)企業(yè)能 及時(shí)生產(chǎn)和驗(yàn)證各批次流感疫苗是至關(guān)重要的。每批疫苗都需根據(jù)其中血凝素(HA)含量評(píng)估效力。流感病毒可利用血凝素(HA)，與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，侵染細(xì)胞。^[1]

目前評(píng)估疫苗批次的金標(biāo)準(zhǔn)方法是單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)試驗(yàn)，它讓病毒抗原在含有抗原特異性抗體的瓊脂糖凝膠中擴(kuò)散。然后，測(cè)量沉淀帶的大小，使用一組校準(zhǔn)過(guò)的參考抗原將沉淀帶的大小與樣品中抗原的數(shù)量相關(guān)聯(lián)^[2]。盡管SRID自1978年以來(lái)一直在使用，但它有一些缺點(diǎn)。首先，它是一種離線(xiàn)方法，因?yàn)闃悠繁仨殢纳�產(chǎn)線(xiàn)上取出，通過(guò)一個(gè)單獨(dú)的過(guò)程進(jìn)行分析。其次，SRID所需的參比血清和抗原試劑可能需要6個(gè)月的準(zhǔn)備時(shí)間，從而導(dǎo)致疫苗批次上市的延遲^[3]。此外，SRID的分析精度和通量也較低^[4]，執(zhí)行SRID大約需要22小時(shí)^[5]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種更快速的方法來(lái)評(píng)估流感和其他疫苗的效力，特別是在流感疫情爆發(fā)時(shí)期。

雖然有其他基于免疫測(cè)定法和色譜法的方法可以確定疫苗制劑中的HA含量，但它們?nèi)狈��?duì)生產(chǎn)中病毒顆粒進(jìn)行過(guò)程分析的能力。免疫測(cè)定也被認(rèn)為是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。而表面等離子體共振(SPR)檢測(cè)可以在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，并且樣本無(wú)需標(biāo)記。通過(guò)表面化學(xué)優(yōu)化和生物分子選擇性捕獲，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物分子的高靈敏度和高重復(fù)性的檢測(cè)。Affinite儀器公司緊湊型的SPR儀器將使基于細(xì)胞的病毒顆粒生產(chǎn)的在線(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成為現(xiàn)實(shí)。

本應(yīng)用案例將展示利用Affinite的P4SPR^TM對(duì)流感疫苗生產(chǎn)中HA含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)的潛在用途。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程
系統(tǒng)設(shè)置和傳感器芯片功能化
本研究使用了配備4個(gè)獨(dú)立微流控通道的P4SPR™(圖1)。
 

圖1     4通道分子互作儀P4SPR^TM

首先，使用去離子水通過(guò)SPR裝置運(yùn)行60s，以確�；�線(xiàn)的穩(wěn)定性。然后，為了減少非特異性結(jié)合，使用我們專(zhuān)有的Afficoat^TM表面修飾的金膜傳感器芯片，并將所有以下蛋白質(zhì)樣品和試劑手動(dòng)注射到P4SPR中(見(jiàn)圖1)。為了激活傳感器表面以捕獲抗體固定，用EDC/NHS處理；隨后用乙酸鈉洗滌。將HA捕獲抗體(10µg/mL)固定于傳感芯片表面，反應(yīng)20分鐘；隨后用乙酸鈉進(jìn)行清洗。為了減少非特異性結(jié)合，通過(guò)注射1 M乙醇胺(pH 8.5)阻斷傳感器表面的活性位點(diǎn)，反應(yīng)10分鐘。然后用運(yùn)行緩沖液沖洗傳感器表面。圖2描述了在金膜傳感器芯片上的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。
 

圖2    SPR法檢測(cè)血凝素的實(shí)驗(yàn)示意圖

HA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
利用運(yùn)行緩沖液制備HA，在A至C通道中從0.5µg/mL滴定至25µg/mL，每次10分鐘。圖3顯示了放置在傳感器芯片頂部的微流控通道圖案。作為對(duì)照，通道D用于注入運(yùn)行緩沖液。每組HA濃度和運(yùn)行緩沖液的SPR信號(hào)位移保存在P4SPR控制軟件中。
 

圖3    四通道分子互作儀P4SPR^TM的微流控通道俯視圖

結(jié)果與討論
初始的P4SPR^TM洗滌、穩(wěn)定和傳感器芯片功能化步驟大約需要38分鐘。注入HA樣品以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)大約需要1小時(shí)。因此，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所需的總時(shí)間約為1小時(shí)40分鐘。

依次注射HA濃度時(shí)，共振信號(hào)成比例增加，證明了HA與固定的抗HA抗體的結(jié)合(圖4)。在每個(gè)HA濃度下，將三個(gè)重復(fù)的共振信號(hào)平均并在Excel中繪制。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2為0.98，表明濃度在0.5-25µg/mL之間具有高度的線(xiàn)性關(guān)系(圖5)。
 

圖4    各濃度HA在通道A, B和C(紅色、白色、綠色 三次重復(fù))以及參照通道D(藍(lán)色)的傳感信號(hào)
 

圖5.  血凝素與抗血凝素抗體結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

結(jié)論
本研究表明，P4SPR^TM可以固定抗HA抗體到我們專(zhuān)有的Afficoat^TM傳感器芯片上，并有潛力通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)檢測(cè)樣品中的HA濃度。傳感器表面準(zhǔn)備可在40分鐘內(nèi)完成，每個(gè)樣品只需要10分鐘即可獲得數(shù)據(jù)。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，P4SPR將能夠在實(shí)際生產(chǎn)和純化疫苗樣品中評(píng)估病毒效力。

Affinite儀器優(yōu)勢(shì)～
Affinite儀器公司的P4SPR^TM四通道設(shè)計(jì)，無(wú)論作多樣本篩選，還是重復(fù)性檢測(cè)，都能輕松實(shí)現(xiàn)。高效便捷和信號(hào)穩(wěn)定是P4SPR的主要特點(diǎn)；也是百萬(wàn)以?xún)?nèi)少有的四通道分子互作儀。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，安裝在線(xiàn)SPR儀器對(duì)疫苗批次進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)是有利的。同時(shí)，在生物醫(yī)藥研究的其他領(lǐng)域，P4SPR也能幫助用戶(hù)揭示生物分子相互作用的奧秘。

參考文獻(xiàn)
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